红花黄色素对控制性低血压诱导的缺血缺氧性脑损伤的影响及机制研究

发布时间：2017-10-21 03:20

  本文关键词：红花黄色素对控制性低血压诱导的缺血缺氧性脑损伤的影响及机制研究

  更多相关文章： 控制性降压 缺血缺氧性脑损伤 红花黄色素 保护作用 nNOS HIF-1α Caspase-3

【摘要】：研究背景控制性低血压(Controlled Hypotention, CH)是一种根据患者手术以及病情的需要而广泛应用于临床的麻醉技术。其目的是减少出血、改善术野环境、减少输血,提高手术期的安全性。然而,患者在手术期间由于其自身条件、手术以及麻醉操作和药物等因素,常可出现心率变慢、血压下降以及呼吸抑制等症状,加上控制性低血压期间常常很难保证重要器官的血液灌注以及氧的供应,尤其是大幅度降压后更易诱发组织器官的缺血缺氧性损害,而脑组织又因其代谢强、缺氧耐受差等特点,相比其他器官更易受到损伤。因此控制性低血压期间最大的顾虑是脑供血不足和脑缺氧引起的脑损伤以及复压后的再灌注损伤。缺血缺氧性脑损伤包括缺血期的原发性脑损伤和再灌注期的继发性脑损伤。诊治脑缺血的根本则是在有效时间窗内尽快消除缺血原因、恢复血液灌流。然而,灌注后的继发性损伤却是很难避免的,其程度直接影响脑损伤的预后。继发性脑损伤即脑缺血再灌注损伤(CIRI)是指缺血脑组织在发生细胞坏死前,缺血组织恢复血液灌注后,其功能不但未能完全恢复,且可能在原来损伤的基础上出现进一步加重的现象。CIRI是一个复杂的病理生理过程,其发病机制涉及多个方面,主要包括：兴奋性氨基酸的毒性、钙超载、线粒体能量代谢障碍及酸中毒、自由基和脂质过氧化、一氧化氮、炎症细胞因子及细胞凋亡。因此保护脑神经细胞结构和功能,避免神经元出现应激损伤和凋亡,成为治疗脑缺血再灌注损伤的关键。细胞凋亡是一种全程由基因控制的主动死亡,所以又称程序性死亡(PCD)。从接收凋亡诱导因素到细胞凋亡大致分为三个阶段,包括：凋亡信号转导阶段、凋亡基因的激活阶段以及执行阶段,影响其中的任何一个阶段都将中断细胞凋亡的发生发展。线粒体作为细胞能量的代谢中心,是连接细胞应激反应和神经元凋亡执行的中心环节,对各种损伤最为敏感,因此也是缺血性损害中的亚细胞靶点,其功能障碍可直接诱导细胞凋亡。一氧化氮合酶(nNOS)是一种钙离子依赖酶,主要存在于神经细胞内,正常情况下,其活性较低,仅产生生理剂量的NO起传递信号的作用。但有研究表明,缺血缺氧性脑损伤能激活nNOS产生过量的NO诱导Glutamate receptor 6 (GIuR6)亚硝基化,进而激活GluR6·PSD95·MLK3信号模式和c-Jun N-terminal kinase(JNK)信号通路以及凋亡信号调节激酶l(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)。而ASK1是对各种刺激起反应的一种细胞死亡的总递质,同时JNK通路也被认为在脑缺血再灌注损伤过程中尤其是程序性细胞死亡过程中发挥着重要的调控作用。低氧诱导因子-la (Hypoxia-inducible factor-la, HIF-la)作为一种低氧敏感性转录因子,在缺血性中风中与其下游的基因表达上调；同时有文献报道,HIF-la被抑制,则蛛网膜下腔出血大鼠的海马神经元的凋亡增加并且认知功能恶化。红花是一种传统中药,属菊科类一年生草本植物。其性温味辛,归心肝二经,目前在心血管及其他器官系统疾病治疗方面已得到广泛应用。红花黄色素(safflor yellow,SYP),亦称为红花黄素,是中药红花的主要活性成分之一,是近年来由红花提取精制而成的静脉制剂的主要成分,现代药理药效学研究发现其具有改善微循环、扩张冠脉血管、降血压、抗氧化、免疫抑制以及保护心肌等多种药理学功效。最近几年有研究也报道红花及其提取物红花黄色素主要通过降低超氧化物歧化酶(MDA)浓度,增加丙二醛(SOD)活性,增强组织的抗氧化能力,从而减轻心、脑、肌肉、肺等多种组织器官的缺血再灌注损伤,而我们前期对脊髓缺血再灌注的研究结果也表明红花注射液能很好的减轻脊髓缺血再灌注损伤,能减少脊髓前角神经元的凋亡。陈铎葆、张积青等学者在对大鼠缺血再灌注损伤的研究中也证实SYP具有脑保护作用,且认为其可能与抑制脑组织内Ca2+超载及兴奋性氨基酸含量、从而抑制细胞凋亡有关。目的基于我们前期研究的关于控制性降压不同水平对海马CA1区的影响结果,发现将MAP降至基础值的45%时,兔海马CA1神经元凋亡程度最严重,而SYP对兔较低CH水平诱导的缺血缺氧性脑损伤的影响及作用机制,目前少见报道。因此,本研究通过建立硝普钠单纯性控制性低血压动物模型,观察红花黄色素对缺血缺氧性脑损伤后线粒体超微结构的损伤程度以及缺血损伤相关蛋白(Caspase-3、nNOS和HIF-1α)表达的影响,探讨低血压状态下SYP对兔脑海马神经元的保护作用以及可能的发生机制,为临床研究提供理论依据。方法1.动物与分组：健康新西兰白兔40只(雌雄各半,体重1.8-2.2Kg,由南方医科大学实验动物中心提供),随机分为5组,每组8只。正常组(N组),控制性降压组(即CH组,平均动脉压[MAP]降至基础值的45%组),SYP预处理组(SYP1组,控制性降压基础值45%前30min静脉给予SYP,2m1/kg,用生理盐水配制,含SYP 1.6mg/ml),SYP后处理组(SYP2组,控制性降压基础值45%开始后30min静脉注射SYP,2ml/kg,用生理盐水配制,含SYP1.6mg/ml),SYP预处理+后处理组(SYP1+SYP2组,控制性降压基础值45%开始前30min和开始后30min均给予静脉注射SYP,2ml/kg,用生理盐水配制,含SYP 1.6mg/ml)。2.模型制作：本研究沿用我们前期的实验方法对新西兰大白兔进行控制性降压模型的制作,具体操作步骤如下：将禁饮禁食12h的实验兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后,在兔台上固定头与四肢。剃除颈前部兔毛,消毒,行气管切开插气管导管并接动物呼吸机机械通气(潮气量21 m1,呼吸51bpm,FiO21.0)。分离右侧颈内静脉、穿刺置管,接延长管输液通路并输液。左侧腹股沟四周剪毛,消毒,于腹股沟下缘靠内测分离股动脉并穿刺置管,接测压转换器通路行平均动脉测压。操作结束,无菌湿纱布覆盖伤口,输注适量乳酸钠林格氏液,补充禁食丧失的液体总量约15ml/kg;将兔台平放于39.5℃恒温毯上保温。待血压稳定15min后,记录此刻基础的平均动脉压(MAP)、心率(HR)、中心静脉压(CVP)。正常组采用5%葡萄糖注射液4ml/(kg.h)连续泵注；降压组及治疗组均采用5%葡萄糖液配制的硝普钠(400ug/ml)开始泵注,10～15分钟内降至目标血压,通过间断的调节泵速,维持目标血压1 h。根据上述分组方案,在对应的时间给予红花黄色素。降压期间所有动物的补液量(包括降压药物液体量),依据CVP调整,尽量减少补液量对血容量的影响。降压完毕后,各实验动物用乳酸钠林格氏液4ml/(kg·h)泵速再灌注2 h后处死。取实验动物海马CA1区神经元组织行病理学检查,采用透射电镜观察线粒体超微结构改变,TUNEL法染色观察脑组织标本的细胞凋亡情况,使用免疫组化及Western blot检测海马组织中nNOS. HIF-1α、以及Caspase-3蛋白的表达。结果1.所有动物模型均制作成功,未出现因麻醉或手术意外的死亡。正常组死亡率为0,CH组死亡6只：2只死于降压45min后,其余4只死于复压开始后,死亡率75%；SYP1、SYP2、SYP1+SYP2组的动物分别死亡1只、2只、1只,均陆续死于复压1h后,其死亡率均低于CH组,有统计学差异(P0.05)。2.透射电镜下观察海马CA1区线粒体超微结构及Flameng评分：N组细胞结构完整,细胞器清晰可见,核仁染色质均匀,未见核固缩碎裂或溶解；CH组可见超微结构损伤较严重,可见核碎裂、溶解,细胞器结构基本被破坏；SYP1组、SYP2组、SYP1+SYP2组损伤较CH组有所减轻,未见明显的核碎裂及溶解,细胞间连接紧密：CH组线粒体Flameng评分较其他组均高(P0.05),其余各组间比较差异无统计学意义(P0.05)。3.TUNEL染色观察凋亡细胞、计算凋亡指数：N组细胞结构正常,可见极少量TUNEL阳性染色细胞；CH组阳性细胞数目显著增多；红花黄色素处理组(SYP1组、SYP2组、SYP1+SYP2组)TUNEL阳性染色细胞较CH组显著减少(P0.05)；但SYP2组凋亡细胞数较其他两组(SYP1组、SYP1+SYP2组)多,差异无统计学意义(P0.05)4.免疫组化和Western blot检测海马CA1区nNOS、HIF-1α、Caspase-3蛋白的表达：与N组相比,CH组nNOS、HIF-1α、Caspase-3表达显著增加；红花黄色素处理组(SYP1组、SYP2组、SYP1+SYP2组)较CH组表达下降,SYP2组与其他两组比较各蛋白含量有所增加,差异无统计学意义(P0.05)。结论1.通过形态学等研究证实红花黄色素对控制性低血压诱导的脑缺血再灌注损伤具有保护作用,在一定程度上可能降低其死亡率；2.在脑缺血再灌注损伤中,红花黄色素起到保护作用可能与减少nNOS和HIF-la的含量有关；3.红花黄色素通过抑制Caspase-3蛋白的表达,减少细胞的凋亡,从而抑制脑缺血再灌注损伤中神经元的凋亡;4.不同给药时间的红花黄色素对缺氧性脑损伤均有保护作用,无明显的时效关系。
【关键词】：控制性降压 缺血缺氧性脑损伤 红花黄色素 保护作用 nNOS HIF-1α Caspase-3
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 引言17-22
• 第二章 实验材料22-26
• 2.1 材料22-26
• 第三章 实验方法26-34
• 3.1 实验分组26
• 3.2 术前准备26
• 3.3 麻醉及手术操作26-27
• 3.4 控制性低血压模型的制作27-28
• 3.5 标本采集与处理28
• 3.6 组织病理学观察及指标检测28-33
• 3.7 统计学处理33-34
• 第四章 结果34-42
• 4.1 一般资料34
• 4.2 动物死亡率34-35
• 4.3 脑海马CA1区神经元透射电镜观察35-36
• 4.4 TUNEL染色检测海马CA1区神经元凋亡36-38
• 4.5 脑海马区nNOS、HIF-1α免疫组化结果38-40
• 4.6 海马CA1区nNOS、HIF-1α、Caspase-3表达的Westeron blot检测结果40-42
• 第五章 讨论42-53
• 5.1 控制性降压诱导的脑损伤模型的建立及相关评价42-43
• 5.2 脑缺血再灌注损伤发生的相关机制及防治研究43-46
• 5.3 红花黄色素对控制性降压诱导的缺血缺氧性脑损伤的影响46-49
• 5.4 红花黄色素对海马CA1区nNOS、HIF-1α的影响49-51
• 5.5 红花黄色素对海马CA1区Caspase-3蛋白表达的影响51-53
• 第六章 结论53-54
• 第七章 不足与展望54-55
• 参考文献55-63
• 文献综述63-69
• 参考文献66-69
• 读研期间研究成果69-70
• 致谢70-71

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