海马内Wnt3a参与环境依赖恐惧记忆调控的机制研究

发布时间：2018-03-31 11:26

  本文选题：获得　切入点：整合　出处：《山东大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景： Wnt蛋白是一种分子量为39-46KD的分泌型糖蛋白,在进化过程中高度保守。分泌到胞外的Wnt分子与细胞膜上Frizzled受体结合后能引起细胞内一系列信号通路的激活,包括Wnt/β-catenin, Wnt/Ca2+和Wnt/PCP通路。根据Wnt信号通路的不同将Wrnt蛋白分为两大类,即经典Wnt蛋白和非经典Wnt蛋白。 Wnt受体及其信号通路中的相关组分在神经系统中有广泛分布。研究发现,Wnt信号通路在神经发育过程中发挥重要作用,如海马的形成,树突形态构建,轴突导向以及突触形成等。近年来,Wnt在成熟中枢神经系统中的作用也越来越受到人们的关注。研究发现,Wnts在成熟中枢神经系统突触可塑性的调控以及成年动物的学习记忆过程中发挥着重要作用。条件性恐惧记忆训练后,小鼠杏仁体脑区中的Wnt1mRNA出现了显著性下降；并且训练前向小鼠杏仁体脑区注射Wnt1蛋白能引起小鼠长时记忆的损伤。与此结果不同,在水迷宫实验中,经过5天训练后,大鼠海马脑区的Wnt7和Wnt5a分子有显著性升高,提示Wnt7和Wnt5a可能会在长时记忆过程中发挥重要作用。在物体识别实验(the object recognition task,ORT)中,训练后立即向背侧海马脑区注射经典Wnt信号通路抑制剂DKK1损伤记忆的整合过程,说明经典Wnt信号通路在海马依赖的记忆整合过程中发挥作用。然而,目前在体研究Wnts参与学习记忆的文章较少,并且在这些研究中所选取的实验模型,研究的脑区各不相同,因此Wnt在学习记忆中到底发挥什么样的作用?是所有的Wnt分子都参与学习记忆过程还是具有特异性?Wnt调控学习记忆的作用机制是什么?不同信号通路在学习记忆中的功能有何异同?目前难有定论。 场景性恐惧记忆(contextual fear conditioning, CFC)是基于巴普洛夫条件反射而建立的,它测定动物学习、记忆不悦经历和环境暗示之间关联的能力。实验中,用环境作为条件刺激(conditioning stimulus, CS),以厌恶性刺激(如足底电击)作为非条件刺激(unconditioned stimulus, US),二者配对出现。动物经历条件恐惧后,当再次接受到条件刺激时,会产生一系列的生理反应,如自主神经紧张及防御性行为增多等。不动(freezing)即是动物防御性行为的一种,被认为是评价啮齿类动物恐惧的可靠指标。这一模型主要用于海马依赖的记忆。 本课题选取海马依赖的联合性学习记忆模型—CFC作为实验模型,采用动物行为学,脑内埋管给药,慢病毒转染,实时定量PCR、免疫荧光及Western blot等分子生物学方法研究小鼠海马脑区中Wnt调节学习记忆的作用及其机制。 目的： 1.探讨海马脑区哪个Wnt在CFC记忆形成中发挥作用。 2.探讨Wnt调节CFC记忆形成的作用机制。 方法： 1.CFC记忆的形成 CFC记忆的形成：可分为记忆的获得及记忆的整合。具体过程如下：训练期：将动物放入测试箱内适应2min,然后给予3次足底电击(0.4mA或0.7mA,2s),两次电击之间的间隔为60s。最后一次电击结束后,动物在测试箱内再放置60s,放回饲养动物的笼子中。整个训练过程持续5min。测试期,即训练期后1h或24h(分别检测短期记忆和长期记忆),将动物放回训练的箱子中,持续5min,在不给予足底电击的情况下计算动物的不动时间作为记忆的指标。不动时间越长,说明CFC记忆形成的越好。 2. Real-time PCR 在CFC训练后不同时间点,将小鼠断头取脑,冰上迅速分离所需脑组织并提取RNA,通过分光光度计检测RNA浓度,同时用OD260/280比值及凝胶电泳判断RNA质量,将质量合格的RNA反转录为cDNA,最后通过Real-time PCR检测内参actin及目的基因,利用2-△△CT方法来检测目的基因的变化情况。 3. Western blot 在CFC训练后不同时间点,将小鼠断头取脑,冰上迅速分离所需脑组织后提取蛋白并检测蛋白浓度。按30ug计算每个样品的上样体积,将蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳,转膜,3%的脱脂牛奶或BSA封闭完毕后分别加入相应一抗孵育过夜,洗涤完毕后加入二抗孵育1h,洗完后用ECL显色。 4.免疫荧光技术 实验动物经相应处理后,用5%水合氯醛麻醉然后用新鲜配制的4%多聚甲醛灌流取脑,后固定,30%蔗糖沉糖后冰冻切片,厚度为30μm,然后进行免疫荧光染色。具体步骤如下：1)洗涤,将脑片放到6孔板,用TBST洗3遍,每次10分钟；2)透化与封闭,0.1M TBS,0.3%trition,10%山羊血清室温封闭1小时；3)一抗孵育,加入抗Wnt3a或GFP一抗后,静音混匀器上4℃C过夜；4)洗涤,TBST洗3遍,每次10分钟；5)二抗孵育,加入相应荧光二抗,避光室温孵育1小时；6)洗涤,TBST洗3遍,每次10分钟；7)贴片,加入防荧光淬灭剂,封片。 5.脑内埋管技术 将雄性C57BL/6小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪,剪开头皮,充分暴露颅骨表面,在显微镜下找准前囟点,以此为零点根据背侧海马及杏仁体脑区坐标分别调整立体定位仪的X轴及Y轴,并找到相应脑区在颅骨表面的定位,在该位置钻孔后,将带有套管的Z轴经孔下移直至目的脑区,固定套管并放入内芯以防止套管堵塞。缝合头皮并将小鼠放回鼠笼恢复一周后开始实验。按照实验设计在不同时间点通过套管向特定脑区注射干预药物。然后观察小鼠行为的改变情况。 6.Lentivirus载体系统构建 按4-5×106cell/ml的密度将293T细胞接种于10cm的皿中,24h后转染,转染前2h换液。转染时将包装质粒及重组载体共转染293T细胞,进行病毒包装和生产,48-72h后收集病毒液；浓缩、纯化病毒液；用高质量的病毒液感染细胞；通过免疫荧光测定病毒滴度并通过免疫组化法分析实验结果；最后用高质量的病毒感染宿主细胞,通过行为学检测目的质粒在CFC学习记忆中的作用。 结果： 1.CFC学习记忆训练能诱导小鼠背侧海马脑区中Wnt3a特异性表达增加。 CFC训练后不同时间点快速取脑分离出背侧海马,用Real-time PCR和Western blot检测背侧海马脑区分布较多的Wnt分子的mRNA及蛋白的表达变化。结果显示,CFC训练后,海马中Wnt3a mRNA及蛋白有显著性升高。并且Wnt3a蛋白水平的升高稍落后于mRNA的升高。同时我们发现,Wnt3a mRNA的升高是特异性的。Wnt家族其他成员(Wnt1、3、4、5a及7a),它们mRNA的表达水平在CFC训练后没有变化。另外,Wnt3a mRNA的升高具有脑区特异性。CFC训练对杏仁核脑区Wnt3a mRNA没有影响。为了确认Wnt3a的表达变化是CFC条件性学习诱导的,我们设立了不同的行为学对照组,包括单独给予条件刺激(CS组),单独给予非条件刺激(US组),来观察Wnt3a的表达变化是否是CFC学习记忆诱导的。研究发现,海马脑区中Wnt3a的表达变化是由于CFC训练过程中CS和US的偶联学习诱导的,并不是CS或US的单独作用。 2.CFC训练引起Wnt3a依赖的Wnt/β-catenin及Wnt/Ca2+信号通路的激活及Wnt3a的释放。 Wnt3a需要从神经元内释放后与膜上的Frizzled受体及辅助受体LRP5/6结合,诱发Disheveld磷酸化,引起下游GSK3β失活,从而使胞浆内P-catenin稳定存在然后聚集进入细胞核内启动基因转录,从而产生生物学效应。在CFC训练后我们通过Western blot的方法检测不同时间点Wnt3a下游信号通路的活化情况。结果显示,CFC训练1h后,p-GSK3β (ser9)明显升高,并且维持到CFC训练后3h。进一步研究发现,CFC训练后,胞浆中总的β-catenin的含量没有变化,但active-p-catenin含量在2、3小时有显著性升高。并且,胞核内β-catenin含量在2、3小时出现了显著性升高,提示核内β-catenin可能在CFC记忆中发挥重要作用。为了进一步确认CFC训练能引起β-catenin入核发挥作用,我们通过Real-timePCR检测β-catenin下游靶基因的转录。结果显示,CFC训练能引起β-catenin下游靶基因mRNA含量的升高。除了经典的Wnt/β-catenin信号通路的激活,我们发现CFC训练也能引起突触中p-CaMKⅡ的升高,说明CFC训练能引起Wnt/Ca2+信号通路的激活。 我们研究发现Wnt3a mRNA及蛋白的升高分别发生在CFC训练后2h和3h,而Wnt信号通路的激活早于Wnt3a合成增加,提示CFC记忆形成过程可能首先诱导Wnt3a的分泌释放,然后出现Wnt3a的合成增加。为了更加确认这一结果,我们通过免疫荧光的方法发现,与未经训练小鼠海马脑区Wnt3a荧光强度相比,CFC训练引起小鼠海马脑区Wnt3a荧光强度下调,从而进一步确定CFC训练能诱导Wnt3a的释放。 以上结果证明,CFC训练能引起Wnt/β-catenin and Wnt/Ca2+信号通路的激活,那么这些信号通路的激活是否依赖于Wnt3a的作用。为了解决这一问题,我们采用训练前海马内微量注射Wnt3a中和抗体的方法,发现CFC训练引起的突触中p-CaMKII的升高被部分阻断。此外,海马内注射WNt3a抗体能完全阻断CFC训练引起的核内β-catenin及其下游靶基因mRNA的升高。说明Wnt/p-catenin与Wnt/Ca2+信号通路的激活依赖于Wnt3a的作用。 3.训练前海马脑区注射Wnt3a抗体损伤CFC记忆的获得。 为了探讨Wnt3a在CFC记忆中的作用,我们采用训练前海马内微量注射Wnt3a中和抗体的方法,发现CFC记忆的获得受到损伤。进一步实验发现,CFC短期记忆(short term memory, STM)及长期记忆(ong term memory, LTM)均受到不同程度的损伤。而训练前向杏仁核脑区注射Wnt3a中和抗体抗体对CFCSTM及LTM没有影响。 4.训练后海马脑区立即注射Wnt3a抗体损伤CFC记忆的整合。 为了进一步探讨Wnt3a在不同记忆过程中的作用,我们通过改变给药时间的方式检测Wnt3a在不同记忆过程的作用。结果显示,训练后立即给予Wnt3a抗体对CFC STM无影响,却损伤了CFC LTM。说明Wnt3a参与CFC记忆的整合过程。而LTM测试前注射Wnt3a抗体对CFC LTM没有影响,说明Wnt3a对CFC记忆的表达没有影响。 5. Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信号通路分别参与CFC记忆的获得及整合。 为了研究Wnt3a通过哪条信号参与CFC记忆的整合过程,我们采用训练后海马内立即注射Wnt3a中和抗体的方法,发现特异性阻断Wnt3a对CFC训练引起的突触中p-CaMKII的升高没有影响。但是,特异性阻断Wnt3a能完全阻断CFC训练引起的核内P-catenin及其下游靶基因mRNA的升高。说明Wnt3a通过调控Wnt/β-catenin信号通路而非Wnt/Ca2+信号通路调控CFC记忆的整合。 为了进一步区分Wnt/β-catenin及Wnt/Ca2+信号通路在CFC记忆不同阶段的作用,我们采用训练后向海马内立即注射DKK1和sFRP1的方法。结果显示,DKK1能完全阻断CFC训练引起的核内β-catenin的升高而对突触中p-CaMKII的升高没有影响。sFRP1则能阻断突触中p-CaMKII及核内β-catenin的升高。 行为学结果发现,海马内中注射DKK1抗体不影响CFC的短期记忆(short term memory, STM),但损害CFC的长期记忆(long term memory, LTM);而sFRP1注射同时干扰了CFC的短期和长期记忆。以上结果,提示Wnt/Ca2+及Wnt/p-catenin信号通路分别参与CFC记忆的获得及整合 6.海马内注射重组Wnt3a能够增强CFC记忆。 我们发现在CFC训练过程中给予一个较弱的足底电击后导致形成的记忆减弱,与此同时突触中p-CaMKII磷酸化和核内β-catenin的含量降低；在这种弱训练后海马内注射重组Wnt3a能够增强突触中p-CaMKII磷酸化和核内β-catenin的含量,并强化CFC记忆的形成。 7. β-catenin作为Wnt3a的下游分子增强CFC记忆的整合。 为了更好的揭示Wnt3a调控CFC学习记忆的机制,我们通过慢病毒过表达稳定存在的ΔN90β-catenin观察对CFC学习记忆的影响。结果显示,过表达active-β-catenin能增强CFC记忆的整合过程而对CFC记忆的获得没有影响。而CFC训练前分别向active-β-catenin过表达小鼠及对照小鼠海马内注射Wnt3a抗体,发现过表达active-β-catenin纠正Wnt3a抗体引起的CFC LTM的损伤,而对CFC STM没有影响,进一步确定β-catenin作岁Wnt3a的下游分子特异的增强CFC记忆的整合而对CFC记忆的获得没有影响。 结论： 1.CFC学习记忆训练能诱导小鼠海马脑区中Wnt3a特异性表达增加。 2.CFC学习记忆训练能引起海马脑区Wnt3a的释放,并且Wnt3a的释放早于Wnt3a的合成,同时CFC训练能引起Wnt3a下游信号通路Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信号通路的激活。 3.Wnt3a是CFC记忆形成的必要且充分条件。 4.Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信号通路分别参与CFC记忆的获得及整合过程。 5.在海马脑区内过表达激活型β-catenin能特异性纠正Wnt3a抗体引起的CFC记忆整合的缺陷,而对CFC记忆的获得没有影响。 意义： 本课题旨在使我们了解Wnt3a参与CFC学习记忆的神经生物学机制,并为将来以Wnt通路为靶标的记忆干预提供新思路和新方法。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q42
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本文编号：1690530