地塞米松激活自噬对软骨细胞衰老影响的研究

发布时间：2018-04-30 10:39

本文选题：地塞米松 + 膝骨性关节炎　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：1.研究背景：膝骨性关节炎是很常见的骨科疾病,随着老龄社会的到来,其发病率以惊人的速度逐年增长,据相关统计资料显示,在50岁以上人口中,膝骨性关节炎发病率仅次于心脏病而居第二位。膝骨性关节炎的从病理学角度上来说是膝关节软骨组织破坏和修复相互交替的复杂过程,同时伴有关节和滑膜组织的继发性炎症。根据这一本质,膝骨性关节炎是许多种因素和过程相互作用及影响造成的最终结果,其发生和发展最关键的环节是软骨的损伤和破坏。膝骨性关节炎的病理过程中,既有关节软骨形态学和功能的修复,又有关节软骨的退行性变,这一病理过程受到多种复杂因素的调控,年龄被公认为是最主要的危险因素。在老年人群中,不但膝骨性关节炎的发病率随年龄增加而升高,而且膝关节软骨组织退变的程度和疼痛等症状也不断加重,其主要原因是随年龄的增长人体各项生理功能而逐渐下降,机体器官组织的衰老,关节软骨的自身修复能力和关节组织保护结构的功能均下降,其他危险因素如果在此时诱发,就极易发展为膝骨性关节炎。衰老是指缺陷和受损的细胞成分进行性聚集,最终导致器官老化和机体组织生理功能下降的过程。在组织水平,生物大分子(DNA、蛋白质和脂质)和细胞器的损伤以及毒性修饰的聚集是衰老的一个非常明显的特点。许多学者发现在衰老过程中内环境维持系统收到损害,现在越来越多的研究开始关注自噬系统的衰老相关性改变。自噬与细胞凋亡和增殖发生过程及稳态维持密切相关,是生命进化过程中具有高度保守性的细胞行为之一,其主要参与细胞内大分子物质循环和再利用、受损细胞器清除降解,在维持细胞内环境的自我稳态及促进细胞生存方面发挥重要作用。当细胞器受损时,为了抑制细胞凋亡程序的启动,通过明显升高其自噬水平从而清除受损细胞器,从而起到保护细胞和组织的作用。在软骨组织退变过程中,软骨细胞的凋亡起着关键作用,因此阻断软骨细胞凋亡发生和发展,有可能促进退变软骨修复,从而减缓甚至阻止膝骨性关节炎病理进程。在抑制软骨细胞凋亡的启动过程中自噬发挥重要的调控作用,提示通过各种方法对自噬进行干预有可能是防治膝骨性关节炎的潜在有效途径之一。2.研究目的：早期采用关节腔注射糖皮质激素可以缓解疼痛并取得良好效果,但是,长期反复注射地塞米松可破坏软骨细胞的代谢平衡,并可以引起软骨细胞的死亡或凋亡,从而减少软骨细胞数量和导致膝关节软骨组织退变程度进一步加重的后果。因此,探索糖皮质激素副作用的机制并寻找应对策略,确保其疗效又减少副作用,显得尤为重要。自噬是否是软骨细胞在糖皮质激素下适应性地升高而对软骨产生一个保护作用?自噬与衰老在地塞米松作用下的关系又如何?尚不得而知。3.研究内容：3.1体外试验部分SD大鼠原代膝关节软骨细胞与地塞米松、3-甲基腺嘌呤(3-MA)混合培养地塞米松(DX)浓度：空白组,0.1ug/mL,1ug/mL,25ug/mL,50ug/mL。3-MA与地塞米松混合分为5组：1 mmol/L 3-MA+0.1ug/mL DX,1 mmol/L 3-MA+lug/mL DX,1 mmol/L 3-MA+25ug/mL DX,1 mmol/L 3-MA+50ug/mLDX,1 mmol/L 3-MA。上述各组和软骨细胞混合培养后第2天,第4天,第6天分别用LysoTracker Red和MDC染色观察自噬囊泡的生成情况,Western blot检测LC3、beclin-1、P62、p70S6K和4EBP1蛋白表达的变化。β-半乳糖苷酶染色分析地塞米松对软骨细胞衰老的影响。3.2大鼠成体祖细胞与软骨细胞共培养诱导其向软骨细胞分化培养大鼠原代成体祖细胞及软骨细胞并鉴定之。将传代的软骨细胞接种于Transwell 6板下层,对照组上层放置培养基,实验组将第二代MAPC细胞接种于上层,孔径为0.3μm的聚碳酸酯膜隔置于中间,。上层于共培养4天后移去,将对照组和实验组细胞悬液放置于5%胎牛血清培养液中,观察细胞形态,第7天终止培养,采用抗Ⅱ型胶原抗体荧光标记软骨细胞。双盲法分别计数两组在荧光显微镜下阳性细胞比例,取平均值并进行统计学分析。共培养14天后,提取细胞RNA。RT-PCR方法检测Ⅱ型胶原mRNA和聚集蛋白多糖含量。测定RNA在280 nm和260 nm处的吸光度,计算RNA浓度和纯度。应用SPSS 19.0进行统计分析,记数资料均采用(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析,P0.05认为差异有统计学意义。3.3单纯切除前交叉韧带建立SD大鼠膝骨性关节炎动物模型SD大鼠10只,仅单纯切除前交叉韧带,术后2周、4周、6周脱颈处死。对不同时间点的SD大鼠膝骨性关节炎动物模型膝关节组织采用HE染色,甲苯胺蓝染色和Masson染色,按照Mankin评分进行分级评定。3.4体内试验部分建立大鼠膝骨性关节炎模型SD大鼠30只,分为A、B、C三组,每组各10只,A组仅切开皮肤模拟造模手术6周后在膝关节注射地塞米松, B组单纯前交叉韧带切断造模术后6周在膝关节腔中注射地塞米松,C组单纯前交叉韧带切断造模术后6周在膝关节腔中注射生理盐水。每组里面又分2个小组(即A1、A2, B1、B2, C1、C2); A1、B1和C1组为术后6周注射一次药物；A2、B2和C2组为术后6周注射-次药物和术后7周注射一次药物。随机取材行膝关节软骨组织的HE染色、Masson染色、番红O固绿染色、β-半乳糖苷酶染色和LC3免疫组化染色进行衰老和自噬的评估。4.研究方法：4.1地塞米松对软骨细胞自噬和衰老的影响4.1.1大鼠原代膝关节软骨细胞培养：用解剖刀将膝关节软骨组织切成1mm3的小块,放入培养皿,用PBS淹盖。收集全部切碎的软骨组织,去除PBS,加入适量的0.5%透明质酸酶,室温下作用5分钟。除去透明质酸酶,再次加入适量新鲜的0.5%透明质酸酶室温下作用10分钟。用0.2%胰蛋白酶冲洗软骨组织碎块2次,去除用过的胰蛋白酶,加入适量新鲜的0.2%胰蛋白酶,37℃下作用30分钟。去除胰蛋白酶,用PBS清洗2次。用适量的0.2%胶原酶清洗5分钟,去除清洗液后再加入适量胶原酶,37℃下作用90分钟。收集上清液,离心三次,收集细胞,把细胞悬浮于适量培养液中(含12%FCS)在75cm2培养瓶中培养。4.1.2试验分组：地塞米松分为5组：空白组,0.1mg/L,1mg/L,25mg/L,50mg/L。3-MA与地塞米松(DXM)混合分为5组：空白组、10mmol/L3-MA、10mmol/L 3-MA+25mg/L DXM、25mg/L DXM。时间点：软骨细胞与上述各组混合培养后第2天,第4天,第6天。4.1.3 Western blot检测软骨细胞的LC-3,Beclin-1的蛋白表达提取和测定总蛋,蛋白制样及电泳,将蛋白质进行转膜,湿转法,封闭与显色4.1.4 LysoTracker Red染色不同浓度的地塞米松作用软骨细胞4天后。使用新鲜的培养基洗涤细胞3遍,滴加LysoTracker Red后在37℃的培养箱中培养30分钟。使用绿色滤光片在倒置荧光显微镜下观察细胞的染色情况。4.1.5 MDC染色经处理关节软骨细胞使用PBS清洗3遍后,使用MDC在37℃培养箱孵育30分钟。PBS洗涤细胞3次,使用紫外激发光直接在倒置荧光显微镜下观察细胞。染色后的细胞再上流式细胞仪进行细胞自噬率的检测。4.1.6 β-半乳糖苷酶染色软骨细胞和25 mg/L的地塞米松混合培养24小时、48小时和72小时后使用p-半乳糖苷酶固定液在室温下固定,再使用p-半乳糖苷酶染液染色12小时后在倒置显微镜下观察细胞。4.1.7 GFP-RFP-LC3测定在地塞米松激素处理前,当软骨细胞的融合度达到50-70%的时候,转染mRFP-GFP-LC3腺病毒。感染复数适宜值为100。37℃下使用腺病毒孵育软骨细胞2小时。再使用地塞米松处理来排除饥饿对自噬的影响。使用不同剂量的地塞米松处理4天后,使用共聚焦显微镜观察软骨细胞中的自噬体和自噬溶酶体。4.1.8 统计学处理全部数据以均数±标准差(mean±SD)表示,采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,组间差异比较采用单因素方差分析,两两之间比较用Turkey's方法进行检测,以P0.05为差异有统计学意义。4.2大鼠成体祖细胞(MAPC)与软骨细胞共培养诱导其向软骨细胞分化4.2.1 MAPC原代培养及鉴定抽取SD大鼠骨髓5 ml注入培养瓶中。培养1天后换液,移去未贴壁细胞,每3天换液1次。细胞80%～90%融合后PBS洗涤2次,胰酶消化1分钟,用吸管吹打至单细胞悬液,离心10分钟后弃去上清液,接种于培养瓶中。倒置相差显微镜观察细胞生长情况,锥虫蓝染色,计数活细胞数,取平均值。将第2代MAPC消化,加入荧光标记抗体,用PBS洗去多余抗体,流式细胞仪检测细胞阳性率。4.2.2软骨细胞原代培养及鉴定将SD大鼠膝关节软骨切成约2 mm3置于无菌试管,PBS冲洗后下离心3分钟。逐次用胰酶及Ⅱ型胶原酶放置孵箱内消化。收集消化液离心3分钟后弃去上清液,以1×105/ml接种于含有DMEM培养液的营养瓶中。原代细胞贴壁融合后传代培养,2天换液一次。观察软骨细胞的形态并甲苯胺蓝染色鉴定。4.2.3 MAPC与软骨细胞共培养收集第2代软骨细胞吹打成单细胞悬液,接种于Transwell 6孔板下层,对照组上层放置培养基,实验组将第二代MAPC细胞以同样密度接种于上层,孔径为0.3μm的聚碳酸酯膜隔置于中间。观察细胞形态变化,两天换液1次。4.2.4共培养对MAPC转化软骨细胞对比共培养4天后移去上层,将对照组和实验组的细胞悬液放置于5%胎牛血清培养液中,每2天换液一次,第7天终止培养,软骨细胞用抗Ⅱ型胶原抗体荧光标记。随机在实验组和对照组各选取10个视野,用双盲法分别计数两组在荧光显微镜下阳性细胞比例,取平均值并进行统计学分析。4.2.5 RT-PCR检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原nRNA含量共培养14天后,提取细胞RNA。RT-PCR方法检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA含量。测定RNA在280 nm和260 nm处的吸光度,计算RNA浓度和纯度。4.2.6统计学处理应用SPSS 19.0进行统计分析,记数资料均采用(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析,P0.05认为差异有统计学意义。4.3单纯切除前交叉韧带建立SD大鼠膝骨关节炎动物模型4.3.1手术操作用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠后,常规备皮消毒手术区域。取膝关节髌旁内侧切口,切开皮肤及关节囊进入关节腔,向外侧牵拉开髌骨,尽量屈曲膝关节以显露前交叉韧带,在直视下横向切断前交叉韧带并行前抽屉试验确认已完全断裂。逐层缝合关节囊及皮肤。4.3.2术后处理每天每只大鼠肌肉注射青霉素20万单位预防感染持续3天。大鼠分别于术后2周、4周、6周脱颈处死。取关节软骨以10%福尔马林固定后行组织学切片观察。4.3.3评估分期膝关节软骨行HE染色、Masson染色及甲苯胺蓝染色,根据不同时间点进行Mankin评分。4.4体内试验部分4.4.1建立大鼠膝骨性关节炎模型SD大鼠水合氯醛腹腔麻醉后膝关节内侧纵向切口,切断前交叉韧带,注意勿损伤关节软骨面,逐层缝合关闭创口。术后每天每只注射丁胺卡那霉素,连续3天,笼内自由活动。术后6周大鼠膝骨性关节炎模型建立。地塞米松药液的配置：一支剂量为0.125g(5ml),按照成人体重60kg计算,人体常规用量为0.42mg/kg,按照人和大鼠用药剂量换算公式为：大鼠剂量(mg/kg)=6.25×0.42mg/kg。即每只大鼠(270g)每次注射 0.709mg (0.028ml)即为相应人体的常规剂量。4.4.2实验分组：SD大鼠30只,分为A、B、C三组,每组各10只,A组仅切开皮肤模拟造模手术6周后在膝关节注射地塞米松, B组单纯前交叉韧带切断造模术后6周在膝关节腔中注射地塞米松,C组单纯前交叉韧带切断造模术后6周在膝关节腔中注射生理盐水。每组里面又分2个小组(即A1、A2, B1、B2, C1、C2);A1、B1和C1组为术后6周注射一次药物；A2、B2和C2组为术后6周注射第一次药物和术后7周注射第二次药物。随机取材行膝关节软骨组织进行HE染色、Masson染色、番红。固绿染色、β-半乳糖苷酶染色和LC3免疫组化染色,分别在镜下观察HE染色切片,Masson染色切片,番红O/固绿染色切片,p-半乳糖苷酶染色切片和LC3免疫组化切片并评估衰老和自噬。5.结果5.1地塞米松对软骨细胞自噬和衰老的影响对地塞米松作用4天后软骨细胞进行Lyso-Tracker染色发现随着地塞米松的浓度增加Lyso-Tracker染色阳性细胞数量也急剧增加。经地塞米松处理的软骨细胞MDC染色和流式细胞仪分析。随着地塞米松浓度的上升,软骨细胞的MDC染色荧光强度明显增加。经地塞米松作用后软骨细胞自噬的发生率与对照组相比明显升高,具有统计学意义。培养4天后,与对照组相比,地塞米松明显促进软骨细胞胞浆中点状的红色荧光和黄色荧光的数量,融合后形成点状的黄色自噬体已经部分红色的自噬溶酶体,并且具有剂量依赖性,这提示地塞米松可以明显促进软骨细胞中自噬流的形成,使得细胞中的自噬体逐渐地转化成为自噬溶酶体。当软骨细胞在不同浓度的地塞米松作用2天后,不同组之间的LC3-Ⅱ/β-actin没有明显差异；但是,LC3-Ⅱ/β-actin表达水平在混合培养4天后随着地塞米松的浓度增加而显著升高；6天后,在地塞米松浓度最高水平LC3-Ⅱ/β-actin的表达稍有下降。在P62、Beclin-1表达水平的变化与LC3-II的表达非常相似。p-p70S6K和p-4EBP1的表达水平在1mg/L和25mg/L地塞米松处理组相对于对照组明显降低,比较差异有统计学意义,这表明地塞米松是通过mTOR依赖途径抑制自噬。随着地塞米松作用时间的延长,关节软骨细胞的p-半乳糖苷酶染色阳性率明显升高,作用72小时后最高。单纯3-MA的作用并没有引起软骨细胞的p-半乳糖苷酶染色阳性率增加。但是采用3-MA与地塞米松共同作用软骨细胞72小时后自噬被3-MA抑制,软骨细胞中p-半乳糖苷酶染色的阳性率相对于单纯地塞米松组明显升高。5.2成体祖细胞(MAPC)与软骨细胞共培养诱导前者向软骨细胞分化在培养后24小时内原代MAPC大多数贴壁,呈多角形。24小时内换液,以后每2天换液1次,8天内贴壁其他细胞多死亡。剩余MAPC形态为长条形或梭形,呈克隆样生长。传代的MAPC细胞在1天内即出现生长,倍增时间约为2天。由生长曲线可见,MAPC在接种1天后开始增殖,第2-4天为对数生长期,第6天时细胞数量达到1.32×106/ml,然后进入平台期。SD大鼠软骨细胞在24小时内贴壁,呈三角形或四角形,6天内贴壁的其他细胞多死亡。剩余的软骨细胞生长旺盛,甲苯胺蓝染色显示软骨细胞存活及传代较稳定。流式细胞仪检测结果表明,SSEA-1和CD13阳性细胞的百分比分别为21.47%和14.31%,说明细胞中MAPC占大部分。RT-PCR结果显示,实验组与对照组聚集蛋白多糖mRNA含量分别是1.46±0.51、6.61±0.34,Ⅱ型胶原mRNA含量分别是2.14±0.48、8.37±0.79,差异有统计学意义(P0.05)。5.3单纯切除前交叉韧带建立SD大鼠膝骨性关节炎模型术后2周HE染色见软骨表面出现少数散在的不规则裂隙；甲苯胺蓝染色均匀且呈深蓝；Masson染色软骨基质被染成蓝色,染色较均匀,细胞排列规则。术后4周HE染色见软骨细胞轻度增生,细胞排列开始出现紊乱,软骨浅层出现裂隙,表层及中层细胞收缩；甲苯胺蓝染色不均匀；Masson染色软骨基质被染成蓝红相间色,细胞分布规则。术后6周HE染色见软骨层变薄,软骨细胞排列层次紊乱,表面纤维化明显,软骨细胞数量有所减少;甲苯胺蓝染色见软骨组织大部分层次染色明显变浅；Masson染色见红色部分面积较多,蓝色部分面积较少。单纯切除前交叉韧带造模术后2周Mankin评分是1.6分,术后4周Mankin评分是4.8分,术后6周Mankin评分是7.2分。5.4地塞米松对膝骨性关节炎动物模型的作用p-半乳糖苷酶染色：A1与B1,C1均有显著性差异,A2和B2有显著性差异,B2和C1有显著性差异；LC3免疫组化：A1与B1有显著性差异,A2与B2有显著性差异,B2与C2有显著性差异。局部注射地塞米松后B1和C1两组及B2和C2两组均无明显差异,并没有导致软骨衰老加重；软骨细胞自噬则表现出收到地塞米松的诱导作用,所以与前面体外软骨细胞部分研究结果相似,地塞米松诱导软骨细胞自噬同时抑制了衰老,因此可以解释有许多患者膝关节局部注射封闭后自觉疼痛症状缓解。6.结论6.1地塞米松诱导软骨细胞的衰老,并同时激活软骨细胞中的自噬,而自噬在这过程中对细胞的衰老可能具有代偿性的保护作用。同时地塞米松抑制mTOR信号通路,可能与自噬的激活相关。6.2成体祖细胞(MAPC)与软骨细胞共培养后可诱导前者向软骨细胞定向分化。6.3单纯切除前交叉韧带法可以造成大鼠膝骨关节炎模型,而且对膝关节组织损伤小,术后6周可以观察到早中期骨关节炎病理变化。6.4中期膝骨性关节炎患者注射地塞米松后不会加重软骨衰老,但自噬会明显发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684.3

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