肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体DR5对动脉粥样硬化斑块形成的影响

发布时间：2018-06-07 22:47

本文选题：动脉粥样硬化 + 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体　；参考：《山东大学》2014年博士论文

【摘要】：背景 TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体),是肿瘤坏死因子超家族的成员之一,由Wiley等于1995年首次从表达序列标签(Expressed sequence tag, EST)数据库中分离和鉴定出来。TRAIL与Fas配体(FasL,Apo1L或CD95)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)分别具有28%和23%的同源性。1996年研究者分离出由281个氨基酸组成、分子量为32.5kD的蛋白质,因其与FasL具有较高的同源性,该研究将其命名为凋亡素配体2(apoptosis2-ligand, Apo2L)。随后的研究发现Apo2L和TRAIL是同一种因子。目前发现的TRAIL受体有5种：TRAIL-R1/DR4(death receptor4)、 TRAIL-R2/DR5(death receptor5)、TRAIL-R3/DcRl (decoy receptor1)、 TRAIL-R4/DcR2(decoy receptor1)和骨保护素(osteoprotegerin, OPG)。按其功能和结构可分为三类：(1)死亡受体：DR4和DR5；(2)诱骗受体：DcRl和DcR2(3)可溶性受体骨保护素。DR4和DR5分别由468和411个氨基酸残基组成,二者有55%的同源性。TRAIL与这两种受体结合后诱导敏感细胞的凋亡。小鼠体内仅有DR5的表达。 TRAIL除了诱导细胞凋亡的作用外,研究还发现TRAIL有调节细胞增殖、迁移、分化,调节免疫应答功能和免疫耐受机制的作用,以及参与调节干细胞的生理功能。TRAIL主要由免疫细胞生产(如自然杀伤T细胞和单核巨噬细胞),而TRAIL的受体在体内是广泛表达的。在血管中,TRAIL受体在平滑肌细胞和内皮细胞中均有表达。因此,越来越多的证据显示TRAIL在调节正常血管生物学功能以及在血管疾病的发生中都可能具有重要作用。TRAIL功能缺失实验证实如果敲除TRAIL基因则导致ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块增大,提示内源性的TRAIL可能对动脉粥样硬化发生具有保护作用。最近,Michowitz等进行的一项临床病例观察研究中,结果显示急性冠脉综合症病人血浆中可溶性TRAIL表达水平明显低于稳定性心绞痛和正常对照组,与C反应蛋白呈现负相关关系。该研究提示TRAIL对ACS患者斑块的稳定性可能起着一定的保护作用。根据这些研究结果人们提出TRAIL有可能作为一种新的治疗手段用于治疗与动脉粥样硬化相关的心血管疾病。然而,TRAIL对动脉粥样硬化的药理作用的量效关系尚没有被系统地诠释,目前一个尚未澄清的重要科学问题是过量产生的或外源性给予的TRAIL是否具真的具有抗动脉粥样硬化作用?值得注意的是,有不少证据显示过高的TRAIL水平可能具有促进动脉粥样硬化发生的作用。例如,有研究报道,外源性TRAIL刺激可以增加血管平滑肌细胞和内皮细胞的炎症反应,上调E-选择素(E-selectin),细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule,(ICAM)-1)和白介素-8(interleukin (IL)-8)的表达。并且,在机体处于炎症状态下血浆TRAIL的水平呈升高趋势,而慢性炎症状态是诱发动脉粥样硬化的重要危险因素。虽然有一项研究报道在动脉粥样硬化合并糖尿病的小鼠中TRAIL可能通过引起巨噬细胞的凋亡而减轻斑块负荷,但这只是在晚期斑块且合并糖尿病的情况下观察到的,而且晚期斑块中巨噬细胞凋亡的增加还可能导致斑块的不稳定。因此,目前的研究证据还不足以证明给予外源性的TRAIL干预对动脉粥样硬化,特别是早期的斑块形成,是具有抑制作用还是促进作用。目的 1.研究外源性TRAIL干预对动脉粥样硬化斑块形成的作用。 2.用双敲基因小鼠模型进一步证实DR5受体在动脉粥样硬化斑块形成的作用。 3.研究TRAIL对早期斑块和晚期斑块不同影响背后的机制。方法 1.实验动物：8周龄雄性apoE-/-小鼠购自北京维通利华公司,8周龄雄性LDLR-/-小鼠购自南京大学模式动物研究所,DR5-/-小鼠购自美国Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC)。所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。 2. TRAIL对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的作用：将8周龄雄性apoE-/-小鼠分成正常对照组和TRAIL过表达组,TRAIL过表达组给予重组TRAIL腹腔注射(3μg每只,每周一次),持续4周或8周。对照组注射等量生理盐水。为了排除高脂饮食对TRAIL的影响,本研究设置普通或高脂饮食组。 3. TRAIL对LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的作用：将8周龄雄性apoE-/-小鼠或LDLR-/-小鼠给予高脂饮食8周,然后在继续高脂饮食的基础上,分成正常对照组和TRAIL过表达组,TRAIL过表达组给予重组TRAIL腹腔注射(3μg每只,每周一次)8周。对照组注射等量生理盐水。4.DR5-/-apoE-/-小鼠模型构建：8周龄apoe-/-和DR5-/-小鼠按照一雄两雌进行交配繁殖,杂一代基因型均为DR5-/-apoE+/-，杂一代在8周龄时继续进行交配繁殖,后代经鼠尾组织DNA提取,PCR扩增后产物电泳分析后分出DR5-/-apoE-/-和DR5+/+apoE-/-小鼠。 5.组织样本采集：各组小鼠均禁食过夜,应用0.8%戊巴比妥钠麻醉后从心尖抽取血液。小鼠安乐死后,分别收集心脏、血管、肝脏等组织。用于分子生物学研究如检测mRNA、蛋白表达等的的组织样本,待分离后置于组织冻存管,迅速放在液氮中防止其裂解,后保存于-80℃备用。用于制备冰冻或石蜡切片并常规染色、组化等研究的组织则置于4%多聚甲醛中4℃固定过夜,后置于1×PBS溶液中。 6.血脂水平检测：从小鼠心尖抽取血液并分离血浆,并检测血浆中总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)和血糖水平。 7.组织学染色以及免疫组织化学染色：主动脉根部组织切片进行HE染色观察形态,进行油红0染色反映斑块内脂质含量,进行Masson染色来评估胶原含量。各指标的蛋白表达情况应用相应的免疫组织化学染色检测,TUNEL染色检测斑块内细胞凋亡。 8.外周血单核细胞表型检测：8周龄雄性apoE-/-小鼠,外源性TRAIL过表达干预2周(对照组注射等量生理盐水)。取外周血,免疫磁珠分选出CD115+单核细胞,流式细胞术检测细胞表面CDllb、Ly6C/Gr1、CCR2、CCR5、CX3CR1的表达。 9.细胞凋亡检测：主动脉根部切片及细胞爬片应用TUNEL染色检测细胞凋亡；悬浮细胞应用Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡。 10.统计学分析：定量数据均以均数±标准差表示,两组之间比较采用独立样本的t检验；多组之间比较采用one-way ANO VA检验及q检验。设P0.05为有统计学意义。结果 1.外源性TRAIL干预促进高脂血症小鼠斑块的生长大体油红O染色提示早期TRAIL过表达组小鼠的自主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉至髂总动脉斑块面积明显高于生理盐水对照组,并且TTRAIL促进斑块生长的作用不受小鼠饮食的影响。横截面切片分析也证实,TRAIL过表达组小鼠主动脉根部的斑块明显高于生理盐水对照组。 2.外源性TRAIL干预不改变apoE-/-小鼠外周血单核细胞表型为了阐明TRAIL是否在外周血单核细胞迁移至血管壁之前就影响其表型,本研究在外源性TRAIL干预2周后,取apoE-/-小鼠外周血CD115+单核细胞,并证实90%的细胞为CDllb+。与对照组相比,外源性TRAIL干预并不影响CDllb+单核细胞表面Ly6C/Gr1、CCR2、CCR5、CX3CR1的表达,提示TRAIL干预引起ApoE-/-小鼠斑块的生长并不依赖于改变外周血单核细胞的表型。 3.外源性TRAIL干预引起血管炎症反应为了研究TRAIL是否引起apoE-/-小鼠血管炎症反应,分离出apoE-/-小鼠的主动脉(升主动脉至髂总动脉)组织进行PCR,检测炎症指标的表达。结果显示,TRAIL干预组血管组织中炎症因子MCP-1, RANTES, VCAM-1和ICAM-1的表达较对照组显著升高,而对CX3CL1的表达没有影响,并且这种作用不受饮食的影响。另外,TNF-α、E-选择素和IL-1也有明显升高。这些证据证实,外源性TRAIL干预引起了apoE-/-小鼠血管炎症反应。应用MCP-1和RANTES的中和抗体合并TRAIL对apoE-/-小鼠进行干预。结果显示,TRAIL导致的斑块增大作用能够被MCP-1/RANTES中和抗体阻断 4.TRAIL促进斑块的生长依赖于受体DR5 为了验证TRAIL的促斑块生长作用是否依赖于其受体DR5,我们将DR5-/-apoE-/-和DR5+/+apoE-/-小鼠分别高脂喂养8周后比较。大体油红O染色显示DR5-/-aooE-/-小鼠的主动脉弓,胸主动脉,腹主动脉和髂总动脉处斑块较DR5+/+apoE-/-小鼠明显减少。横截面切片分析也证实,DR5-/-apoE-/-小鼠主动脉根部的斑块明显低于DR5+/+apoE-/-小鼠。而外源性给予DR5-/-apoE-/-小鼠TRAIL干预后,斑块面积也没有显著变化。 5.TRAIL引起斑块内巨噬细胞凋亡并和细胞内内质网应激状态相关以往研究发现TRAIL可减小糖尿病小鼠晚期斑块的面积,提示TRAIL可能对早期和晚期斑块有不同的作用。我们通过文献研究发现早期斑块和晚期斑块中巨噬细胞的一个不同点是晚期斑块的巨噬细胞可能存在明显的内质网应激反应(ER stress)。基于以上问题,我们提出假设：晚期斑块中巨噬细胞的内质网应激反应能通过上调DR5受体的表达增加巨噬细胞对TRAIL诱导凋亡作用的敏感性。通过TUNEL染色,我们观察到,在apoE-/-小鼠斑块形成早期(8周),TRAIL并没有引起斑块内细胞凋亡的显著增加,而到了斑块形成晚期(16周),较对照组而言,外源性TRAIL引起明显的斑块内细胞凋亡的增加。体外实验证实,TRAIL主要引起巨噬细胞的凋亡。我们检测了早期斑块(8周)和晚期斑块(16周)中内质网应激反应的水平,发现在晚期斑块中CHOP和GPR78的表达水平明显升高。在体外培养的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)和人单核巨噬细胞(THP-1)中观察用衣霉素(tunicamycin,Tm)处理诱导产生内质网应激后,DR5、CHOP和GPR78表达升高,TRAIL引起的凋亡反应增强。为明确ER stress上调DR5表达的分子生物学机制,根据以往文献报道,CHOP蛋白可能与DR5的启动子(promoter)结合,直接调控DR5的转录水平。我们用siRNA抑制CHOP的表达,发现Tm诱导DR5表达增加的作用被抑制了(图41)；同样我们应用siRNA抑制CHOP.DR5的表达,TRAIL引起的细胞凋亡也相应减少。最后我们利用染色质免疫沉淀(CHIP)的方法检测到CHOP和DR5的启动子区域直接结合,tunicamycin处理后CHOP的结合增多。结论 (1)外源性TRAIL干预可显著加重高脂血症小鼠AS的病变,并且不受饮食方式的改变的影响。 (2) TRAIL是通过引起apoE-/-小鼠血管组织固有细胞的炎症反应而不是改变血液中单核细胞的表型起到促AS形成的作用。 (3)动脉粥样硬化晚期斑块中巨噬细胞存在内质网应激,内质网应激通过上调DR5受体的表达增加巨噬细胞对TRAIL诱导凋亡作用的敏感性。这种机制可能解释为什么TRAIL对晚期斑块内巨噬细胞的致凋亡作用与早期斑块的不同。背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是由多种病因导致的始发于动脉壁内膜的一系列复杂细胞和分子改变的总结果。目前比较公认的是AS发生的慢性炎症假说。研究指出AS病变是一种具备慢性炎症反应特征的病理过程：AS的发展过程在正常情况下实际上是一种血管壁内皮细胞和平滑肌细胞损伤的保护反应。在这个过程炎症反应是始终伴随着的,而当反应过度时就演变为疾病状态进而导致动脉粥样硬化发生。动物实验证明,AS病变的形成主要与三个过程有关：(1)内皮细胞的损伤,平滑肌细胞的增生、淋巴细胞及巨噬细胞浸润,释放炎症及趋化因子；(2)由平滑肌细胞分泌胶原纤维、弹性纤维蛋白等结缔组织基质的形成；(3)脂质(包括游离的以及被修饰的脂蛋白)在基质和泡沫细胞中的聚积。慢性炎症状态是诱发动脉粥样硬化的重要危险因素。炎症因子促进动脉粥样硬化炎症的发生可能通过两条途径：改变血液中免疫细胞(主要是单核细胞)的表型和功能促进血管炎症发生；改变血管组织本身固有细胞的炎症反应。在前期试验中我们在apoE-/-小鼠中检测了TRAIL干预对外周血CD115+/CD11b+单核细胞表型的影响,发现TRAIL对外周血单核细胞表型变化的影响不显著,而血管组织中炎症因子的表达显著增加。在体外培养的人肺动脉和主动脉中层平滑肌细胞中,可检测到有TRAIL mRNA及蛋白的表达,同时也可有死亡受体的表达。Sato等通过检测人颈动脉斑块中的平滑肌细胞,证实DR4、DR5和Fas受体均有表达,DR4的表达相对微弱,而DR5、FasL的表达非常高。免疫组织化学显示位于斑块纤维帽区域的VSMC表达DR5,而正常颈动脉壁不表达。在动脉粥样硬化的发生发展过程中,游走于内膜下的巨噬细胞吞噬脂质(尤其是各种被修饰的脂蛋白)从而转变为泡沫细胞是极其重要的一环,是斑块形成的起始。研究证实,巨噬细胞吞噬脂质主要是通过其表面的清道夫受体(scavenger receptors, SRs)实现的。巨噬细胞表面的清道夫受体主要包括：A型清道夫受体(SR-AI和SR-AII)、B型清道夫受体(SR-BI)、CD36和LOX-1。然而,TRAIL是否影响巨噬细胞表面的清道夫受体的表达从而影响其脂质吞噬的过程至今未有报道。肥胖可以增加动脉粥样硬化的风险,其中脂肪因子(adipokines)被认为是脂肪调节心血管生理和病理的关键信使分子。脂肪组织可产生多种脂肪因子如TNF-α、白介素等,可由脂肪细胞或脂肪间质细胞产生。TRAIL是TNF家族的成员之一,那么是否也可作为脂肪因子由脂肪组织生产? 基于以上研究,我们提出假说：TRAIL可能影响血管细胞的炎症反应；TRAIL可能通过影响巨噬细胞表面清道夫受体的表达进而影响巨噬细胞的脂质吞噬,从而影响AS斑块的进程；TRAIL可能作为脂肪因子由脂肪组织产生并参与肥胖伴随的动脉粥样硬化。目的 1.研究TRAIL对内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞炎症反应的影响。 2.研究TRAIL对巨噬细胞脂质吞噬的影响。 3.探讨TRAIL在肥胖伴随的动脉粥样硬化形成中的作用。方法 1.细胞培养：HUVEC为人脐静脉内皮细胞,以ECM(含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1%生长因子)贴壁培养。RAW264.7细胞为小鼠巨噬细胞,以高糖DMEM(含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素)贴壁培养。THP-1细胞为人单核/巨噬细胞,以RPMI-1640(含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素)悬浮培养。小鼠血管平滑肌细胞以酶消化法自C57小鼠血管组织中分离,以高糖DMEM(含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素)贴壁培养。 2.细胞炎症反应检测：HUVEC、RAW264.7及小鼠原代平滑肌细胞分别以TRAIL(10ng/ml)、TNF-a(20ng/ml)刺激6、12、24小时。收集细胞,提取细胞总mRNA,应用RT-PCR的方法检测intercellular adhesion molecule (ICAM)-1、 vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1、monocyte chemoattractant protein (MCP)-1、E-selectin等炎症因子的表达。 3.巨噬细胞表面清道夫受体表达测定：RAW264.7和THP-1细胞分别以TRAIL0.1、1、10和100ng/ml的浓度刺激24小时,然后选择最佳浓度刺激细胞2、4、8、16和24小时以检测时间依赖性。收集细胞,提取细胞总mRNA,应用RT-PCR的方法检测SR-AI、SR-B1、CD36、LOX-1清道夫受体的表达。 4.巨噬细胞脂质吞噬功能测定：RAW264.7和THP-1细胞种于八孔腔室玻片,THP-1细胞以phorbol myristate acetate (PMA,100nM)诱导分化。细胞以TRAIL刺激后,将DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)(30⒚g/ml)加入培养基中,继续培养2-8小时,然后将细胞固定、染核,于激光共聚焦显微镜观察荧光强度以检测细胞对DiI-Ac-LDL的吞噬能力；RAW264.7细胞以TRAIL刺激后,将ox-LDL (80μg/ml)加入培养基中,继续培养48小时,然后将细胞固定,应用0.3%油红O染色,苏木素染核,光学显微镜下观察细胞内脂质含量以观察泡沫细胞的形成情况。 5.为了阐明TRAIL主要通过哪种清道夫受体起作用,本研究应用SR-AI抑制剂poly(I:C)、SR-AI siRNA、SR-BI抑制剂BLT-1分别抑制RAW264.7和THP-1细胞表面SR-AI和SR-BI的作用,然后再以TRAIL刺激细胞,观察细胞的脂质吞噬。 6.为确定TRAIL影响泡沫细胞形成是否通过结合DR5受体,本研究提取野生型C57BL/6小鼠和DR5-/-小鼠腹腔巨噬细胞,分别以TRAIL刺激,应用0.3%油红O染色以观察泡沫细胞的形成情况。 7. TRAIL细胞通路因子的测定：RAW264.7和小鼠原代平滑肌细胞分别以TRAIL(10ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)刺激5、10、20、30、60及120分钟,收集细胞,提取细胞总蛋白,应用western-blot的方法检测ERK1/2、p-ERK1/2、p38、 p-p38、JNK、p-JNK、FADD、TRAF2等信号蛋白的表达以检测TRAIL与受体结合后对细胞通路的激活。应用UPSTATE(?) Non-Radioactive Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay试剂盒检测NF-kB的激活。 8.为了阐明TRAIL引起的炎症反应及脂质吞噬所激活的细胞通路,本研究分别应用ERK抑制剂U0126,p38抑制剂SB202190, JNK抑制剂.NK Inhibitor II和NF-kB抑制剂Wogonin将细胞通路阻断,再用TRAIL刺激细胞,观察细胞的炎症反应及脂质吞噬。 9.检测ob/ob巴胖小鼠及Ⅱ型糖尿病大鼠血浆及脂肪组织中TRAIL的表达,与正常C57BL/6小鼠及Wistar大鼠相比较。免疫组化的方法检测ob/ob小鼠、Ⅱ型糖尿病大鼠内脏脂肪、人心包脂肪组织中TRAIL蛋白表达。10.统计学分析定量数据均以均数±标准差表示,应用双侧t检验或one-way ANOVA检验。设P0.05为有统计学意义。结果 1TRAIL上调平滑肌细胞、巨噬细胞炎症因子的表达 TRAIL (10ng/ml)刺激血管平滑肌细胞后,自6小时起ICAM-1表达上调,12小时后ICAM-1、VCAM-1与对照组相比表达显著增高,MCP-1的表达也在24小时后上调。以TRAIL刺激RAW264.7细胞,在6小时后MCP-1、VCAM-1的表达上调。而TRAIL对内皮细胞炎症因子的表达没有影响,以终浓度10ng/ml的TRAIL刺激HUVEC细胞24小时,E-选择素、ICAM-1、VCAM-1的表达与对照组相比,差别均无统计学意义。 2TRAIL引起细胞的炎症反应依赖于p38或NF-kB的激活与TNF-a类似,TRAIL在平滑肌细胞和巨噬细胞中均能够激活MAPK通路。TRAIL刺激平滑肌细胞20分钟后,ERK1/2、p38、JNK的磷酸化水平升高,持续120分钟。同样,TRAIL刺激RAW264.7细胞20分钟后,ERK1/2、JNK的磷酸化水平升高,p-p38的水平自10分钟起就开始升高,并持续120分钟。应用U0126预处理细胞后,TRAIL仍然能够引起平滑肌细胞的炎症因子表达增高；应用JNK Inhibitor II预处理细胞后,TRAIL导致的VCAM-1表达增高的反应被抑制,而MCP-1、ICAM-1的表达仍上调；而应用SB202190或Wogonin预处理细胞,TRAIL引起的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1表达增高的反应均被抑制。 3TRAIL可增加巨噬细胞的脂质吞噬和泡沫细胞的形成 TRAIL(10ng/ml)刺激RAW264.7细胞24小时,在培养基中加入DiI-Ac-LDL4小时后,TRAIL刺激组RAW264.7细胞内红色平均荧光强度显著高于对照组,至8小时时达到高峰。10ng/ml TRAIL刺激THP-1细胞24小时后(THP-1细胞提前24小时以100ng/ml PMA诱导分化),在培养基中加入DiI-Ac-LDL,细胞内平均荧光强度在8小时后明显高于对照组。同样以10ng/ml TRAIL刺激RAW264.7细胞和THP-1细胞24小时后(THP-1细胞提前24小时以100ng/ml PMA诱导贴壁),在培养基中加入ox-LDL,继续培养48小时,油红O染色显示,TRAIL刺激组细胞内脂质含量显著高于对照组。 4TRAIL促进泡沫细胞形成的过程依赖于DR5 为了证明TRAIL促进巨噬细胞脂质吞噬是否通过结合受体DR5实现的,我们分别提取了DR5-/-及野生型(DR5+/+)小鼠的腹腔原代巨噬细胞,以TRAIL刺激后观察其吞噬ox-LDL的变化。DR5+/+巨噬细胞经TRAIL刺激后,细胞内脂质含量显著增加,而DR5-/-巨噬细胞经TRAIL刺激后,细胞内脂质含量较对照组无明显差别。 5TRAIL上调巨噬细胞表面清道夫受体SR-AI、SR-BI的表达以0.1、1、10、100ng/ml的TRAIL刺激RAW246.7细胞24小时,SR-AI和SR-BI的表达显著增高,以10ng/ml的浓度达到最大效应。而CD36和LOX-1的表达较对照组差别无统计学意义。然后以10ng/ml的浓度刺激RAW246.7细胞2、4、8、16、24小时,结果显示,TRAIL刺激组SR-AI和SR-BI表达持续升高,在24小时时达到高峰。最后以10ng/ml TRAIL刺激RAW246.7细胞24小时,TRAIL刺激组SR-AI蛋白表达显著高于对照组。以1、10、100ng/ml的TRAIL刺激THP-1细胞24小时,SR-AI和SR-BI的表达显著增高,以10ng/ml的浓度达到最大效应。而CD36和LOX-1的表达较对照组差别无统计学意义。以lOng/ml TRAIL刺激细胞24小时,SR-AI的蛋白表达显著高于对照组。为了证明TRAIL上调SR-AI和SR-BI的表达是否是DR5受体依赖的,我们同样提取了DR5-/-及野生型(DR5+/+)小鼠的腹腔原代巨噬细胞,以TRAIL刺激后观察SR-AI和SR-BI表达的变化。DR5+/+巨噬细胞经TRAIL刺激后,SR-AI和SR-BI的表达显著增加,而DR5-/-巨噬细胞经TRAIL刺激后,SR-AI和SR-BI的表达较对照组无明显差别。 6TRAIL增加巨噬细胞的脂质吞噬依赖于SR-AI应用SR-BI抑制剂BLT-1(5μM)预处理细胞2小时后,TRAIL (10ng/ml)刺激24小时仍能增强RAW246.7细胞和细胞THP-1细胞吞噬DiI-Ac-LDL的能力。而应用SR-A抑制剂poly(I:C)(1μM)预处理后,RAW246.7细胞和细胞THP-1细胞经TRAIL刺激其吞噬DiI-Ac-LDL却没有增加。以上结果提示,TRAIL增加巨噬细胞的脂质吞噬可能依赖于SR-AI。为了进一步验证,我们合成了SR-AI siRNA,转染RAW246.7细胞后,SR-AI的mRNA和蛋白表达较基础水平下降70%, TRAIL (10ng/ml)刺激后表达也不再升高。与抑制剂作用相同,转染SR-AI siRNA后TRAIL也不能促进RAW246.7细胞吞噬Ac-LDL。 7TRAIL引起巨噬细胞脂质吞噬增加依赖于p38或NF-kB的激活应用U0126和.NK Inhibitor Ⅱ预处理细胞后,TRAIL仍然能够引起RAW246.7细胞的SR-AI表达增高；而应用SB202190或Wogonin预处理细胞,TRAIL引起的SR-AI表达增高的反应均被抑制,这些结果提示,TRAIL引起细胞的SR-AI表达增高及脂质吞噬反应也依赖于p38或NF-kB的激活。 8TRAIL在肥胖动物的脂肪组织及血清中表达增高 ob/ob肥胖小鼠血浆中TRAIL的含量显著高于野生型小鼠,脂肪组织中TRAIL mRNA的表达也显著增高。Ⅱ型糖尿病大鼠脂肪组织中TRAIL mRNA的表达水平与对照Wistar大鼠相比显著增高。然后,我们应用免疫组化的方法检测了小鼠、大鼠和人心包脂肪组织的TRAIL蛋白表达,结果显示,脂肪的间质细胞(stromal cell),而并非脂肪细胞本身,高表达TRAIL。结论 1. TRAIL促进血管平滑肌和巨噬细胞炎症因子表达增加； 2. TRAIL通过结合DR5受体增加巨噬细胞表面清道夫受体SR-AI的表达,促进脂质吞噬和泡沫细胞的形成； 3. TRAIL促进炎症反应及脂质吞噬依赖于p38或NF-kB的激活； 4. TRAIL可能作为一个新的脂肪因子参与肥胖伴随的动脉粥样硬化的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R543.5

【参考文献】