自由活动小鼠痫样钙信号特征分析及干预

发布时间：2020-06-11 00:31

【摘要】：研究目的癫痫是一种多病因脑功能障碍综合症,随着相关研究不断发展,普遍认为癫痫的发作与群体神经细胞异常的同步放电有关。本研究基于癫痫发生的钙假说,利用多通道光纤光度测定方法(Multi-channel fiber photometry),在腹腔注射海人酸(Kainic acid,KA)诱导自由活动小鼠急性痫样发作前后,同步记录海马(Hippocampus)CA1区和初级运动皮层(Primary motor cortex)M1区出现的钙信号,分析两个脑区的钙活动特征及其与小鼠行为学表现的关联,并研究在海马CA1区局部光解笼抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的光敏复合物Rubi-GABA,对初级运动皮层M1区痫样钙信号和小鼠行为学发作严重程度的影响。研究内容1.麻醉状态海马CA1区和初级运动皮层M1区钙信号的同步记录及特征分析;2.清醒自由活动状态和腹腔注射KA诱发急性痫样发作状态,海马CA1区和初级运动皮层M1区的钙信号同步记录及特征分析;3.在海马CA1区局部光解笼Rubi-GABA对初级运动皮层M1区痫样钙信号和小鼠行为学发作严重程度的影响。研究方法1.实验对象和分组:选用SPF(Specific pathogen free)级别8~12周的雄性C57BL/6小鼠为研究对象。观察KA诱发痫样发作部分,实验分为腹腔注射生理盐水对照组和腹腔注射10mg/kg剂量KA实验组;海马CA1区局部光解笼Rubi-GABA部分,实验分为生理盐水+光照对照组和Rubi-GABA+光照实验组;2.急性痫样发作建模和行为学评价:腹腔注射10mg/kg剂量KA溶液诱发急性痫样发作。对小鼠给药前10min和给药后1.5h的行为学表现进行视频录制(与钙信号同步记录),按照改进的Racine分级法则对小鼠痫样发作行为评级,出现Ⅰ级以上发作则认为诱发发作成功,将Ⅲ级以上统称为惊厥性运动发作(Convulsive motor seizure,CMS);3.钙信号记录:实验小鼠进行开颅手术后在其海马CA1区和初级运动皮层M1区注射加载钙离子指示剂Cal-520 AM,并在其上方植入记录光纤收集信号;4.光解笼Rubi-GABA:实验小鼠进行开颅手术后在其海马CA1区注射Rubi-GABA,并在其上方植入光纤用于局部光解笼。参与局部光解笼所需激发光的耦合光路的搭建,用于光解笼的光纤端面的输出功率调整为15m W;5.钙信号分析与统计:采用基于MATLAB编写的Op Signal多通道分析软件对钙信号进行读取和分析,其中钙活动的幅值用△F/F表示;用Clampfit 10.6统计钙活动的幅值、频率和持续时间;用Graphpad Prism7进行配对样本的非参数检验。研究结果1.麻醉和清醒状态下同步记录海马CA1区和初级运动皮层M1区的钙信号:a)异氟烷/氧气体积分数为1.2%的条件下,CA1区钙信号的幅值为1.54±0.35%△F/F,频率为0.10±0.005Hz,M1区钙信号的幅值为1.76±0.29%△F/F,频率为0.14±0.03Hz;b)异氟烷/氧气体积分数为0.8%的条件下,CA1区钙信号的幅值为0.78±0.17%△F/F,频率为0.20±0.02Hz,M1区钙信号的幅值为1.16±0.14%△F/F,频率为0.38±0.04Hz;c)清醒自由活动条件下,CA1区钙信号的幅值为0.92±0.20%△F/F,频率为0.32±0.06Hz;M1区钙信号的幅值为1.05±0.17%△F/F,频率为0.35±0.04Hz。2.急性痫样发作状态下同步记录海马CA1区和初级运动皮层M1区的钙信号:a)海马CA1区的钙信号表现为两种大类型,一种是基线升高且具有较长持续时间式钙波,另一种是基线平稳的簇状高频脉冲式钙波。第一种类型的钙波又分为两小类,第一种由钙积聚(build-up)和特征类似于皮层扩布抑制(Cortical spreading depression,CSD)的大波组成,这种CSD样钙波的幅值最大,为42.64±9.74%△F/F,持续时间最长,为216.50±26.25s;第二种单独出现的非CSD样钙波的幅值为15.18±3.29%△F/F,持续时间为70.75±12.47s。基线平稳的簇状高频脉冲式钙波的幅值为9.83±2.64%△F/F。b)初级运动皮层M1区的钙信号仅表现为基线升高且具有较长持续时间式钙波,和海马CA1区痫样钙信号相似,其中也分为两个小类,CSD样钙波幅值为32.79±4.55%△F/F,持续时间为333.50±66.65s;非CSD样钙波幅值为4.08±0.91%△F/F,持续时间为92.50±21.75s。3.海马CA1区局部光解笼Rubi-GABA对初级运动皮层M1痫样钙信号的影响:在初级运动皮层M1区出现痫样钙信号时在海马CA1区进行持续时间为30s的光照,观察到初级运动皮层M1区痫样钙信号“变形”,即明显幅值上升和出现高频震荡脉冲波形,与生理盐水对照组有明显区别,且对钙波出现伴随的行为学发作有加重效果。结论1.麻醉状态下,海马CA1区和初级运动皮层M1区的钙信号具有一定的同步性,且其幅值和频率具有麻醉浓度依赖性,麻醉浓度越大,钙信号频率越低,幅值越大。不同麻醉浓度下分别具有统计学差异。2.腹腔注射KA诱发急性痫样发作状态下,海马CA1区和初级运动皮层M1区中,基线抬升且具有一定持续时长式的钙波出现时具有一定的同步性,特别是非CSD样钙活动;CSD样钙活动在两个脑区均各自出现,且在CA1区出现的次数均高于M1;簇状高频脉冲式钙波则仅出现在海马CA1区。不同种类的钙信号的出现与行为学表现有一定的对应关系。3.在海马CA1区局部光解笼Rubi-GABA会出现对初级运动皮层M1区痫样钙活动和行为学发作有加重其异常和无效的结果。
【图文】：

示意图,方法,示意图,检测技术

Adelsberger 等人首次采用了如图 1 所示的基于光纤的方法，记录到了非麻醉的新生小鼠大脑皮层神经元的自发反复的钙瞬变现象[26,27]。2007 年，Murayama 等人利用基于光纤的设备结合 OGB-1AM 记录到麻醉和自由活动大鼠新皮质 5 层锥体神经元树突的钙活动[27,28]。2010 年，Lütcke 等人记录到了清醒自由活动小鼠桶状皮层锥体神经元的钙信号[29]。2012 年，Schulz 等人记录到了大鼠体感皮层的钙活动[30]。2013 年，Pashaie 等人发表了光纤光度检测技术的设计思路，研发的光纤探头中的多模光纤是可植入型，在将激发光传送到目标脑区的同时将收集到的信号传送回检测器[31]。2014 年，Deisseroth 等人命名了光纤光度检测技术，同时利用该技术观测了神经元轴突末端活动和相关的动物行为；还结合了光遗传学技术，证明在社交行为中腹侧被盖区到伏隔核的神经投射起着非常重要的作用[32]。同年 Cui 等人发表了单光子计数光纤系统（Time-correctedsingle-photon counting based fiber optics system, TCSPC），能够实现自由活动小鼠深部脑区荧光指示剂各项参数的测量[33]。光纤光度检测技术快速发展，并被越来越多地运用于各类生理状态或疾病模型的研究中，，包括抑郁症[34]，自闭症[35]，癫痫[36]，奖赏等[37]。

神经活动,显微成像系统,记录方法,说明书

图 2 现有神经活动记录方法比较（引自千奥星科微型显微成像系统说明书）双光子荧光显微镜钙成像能在环路水平记录单个特定类型神经细胞的功能活动[38]。双光子显微镜与普通显微镜相比，优点在于光毒性和光漂白作用较小；时间分辨率更高，可以捕捉到钙动力学现象；空间分辨率也很好，能够观察到亚细胞结构[27,39]。其局限性在于实验动物需要头部固定，无法观察更加复杂的行为学实验[40]，如动物社交实验[27]。且绝大多数研究只能在大脑的皮层开展，成像深度小，深部脑组织成像，如海马、杏仁核等，要么几乎无法实现，要么需要去除目标脑区上方的脑组织，会造成较为严重的损伤[41]。另外，双光子显微镜系统机构庞大，价格昂贵，搭建、发展、维护和改进都存在很多困难，限制了其应用范围。微型显微成像技术利用 GRIN 梯度折射透镜为植入镜头，将其与超小型成像CMOS 芯片结合，能够实时观察自由活动动物单细胞水平神经细胞活动的钙信号。其优点在于系统体积小，重量轻，基本不限制小鼠和其他常用实验动物（如哺乳类动物）的行为，能够应用的行为范式多样；还可以提供神经环路水平几十到几百个神经元的钙信号，为神经网络机制的研究提供更丰富的信息。但这
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.1

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