脐带间充质干细胞治疗急性肺损伤模型的机制探讨

发布时间：2020-06-26 11:07

【摘要】：第一部分UC-MSCs对ALI模型的治疗作用目的：完善UC-MSCs胚胎干性相关基因检测；建立脂多糖(LPS)诱导的C57BL/6和BALB/C两种遗传背景的急性肺损伤(ALI)模型,观察UC-MSCs对不同背景小鼠ALI的治疗作用,证实UC-MSCs治疗LPS诱导的急性肺损伤疗效具有普遍性。方法：用荧光定量PCR方法检测UC-MSCs胚胎干性相关基因OCT-4、SOX-2、NANOG、SSEA-4的表达；将C57BL/6小鼠分别随机分成3组：Ctrl空白对照组(PBS+PBS)、ALI组(LPS+PBS)、ALI +UC-MSCs治疗组(LPS+UC-MSCs),每组24只；BALB/C小鼠分组和处理方法相同。腹腔麻醉后行气管插管术,Ctrl组给予30μ1 PBS, ALI组和ALI+UC-MSCs组分别给予30μl LPS(5mg/kg)。1h后ALI+UC-MSCs组给予80μl新鲜制备的UC-MSCs细胞悬液(细胞数量0.5×106)。Ctrl组和ALI组分别给予PBS(80μl)。观测各组小鼠体重和生存率的变化,24h、72h、120h处死老鼠收集标本,HE染色检测肺组织病理改变,检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及其分类计数、总蛋白浓度和MPO活性。结果：UC-MSCs中胚胎干性相关基因SSEA-4表达量较高,达到胚胎干细胞表达量的1/4,但是UC-MSCs基本不表达其他胚胎干性相关基因OCT-4、SOX-2、NANOG。经气管插管术给予LPS构建C57BL/6背景的ALI模型,与Ctrl组相比,病理染色结果显示大量炎症细胞浸润、肺出血、肺泡间隔增厚,表明C57BL/6ALI模型构建成功。UC-MSCs治疗后,C57BL/6ALI和BALB/C ALI两种小鼠的体重和生存率都明显提高(p0.05)。UC-MSCs治疗C57BL/6 ALI模型24h、72h、120h后,小鼠肺组织炎症明显下降,肺病理损伤明显降低,BALF中细胞总数和中性粒细胞分类计数、总蛋白浓度和MPO活性明显减低(p0.05)结论：胚胎干性相关基因SSEA-4在维持UC-MSCs干性中具有重要意义。UC-MSCs对BALB/C和C57BL/6不同遗传背景的ALI小鼠都有很好的治疗效果,证实了UC-MSCs治疗ALI的普遍性,为其临床研究和治疗ALI提供了新的证据。第二部分UC-MSCs对ALI模型免疫反应的调节作用目的：探究UC-MSCs对ALI模型体内免疫反应的调节作用,明确UC-MSCs治疗ALI的细胞分子机制。方法：用蛋白芯片检测UC-MSCs治疗后ALI小鼠BALF中308种蛋白表达量的变化。通过GO-term和KEEG-Pathway分析这些差异性蛋白的生物学功能,揭示UC-MSCs是否具有调节ALI小鼠体内免疫反应的作用,并筛选与其有关的具体免疫细胞。采用荧光定量PCR和ELISA验证蛋白芯片的结果。流式细胞术检测UC-MSCs治疗后ALI小鼠肺泡巨噬细胞数量和胞内IL-10表达量的改变；体外细胞实验用UC-MSCs干预LPS诱导的巨噬细胞炎症模型,观察巨噬细胞形态变化以及ELISA检测其TNF-α、IL-10表达变化。结果：蛋白芯片结果显示UC-MSCs治疗72h后ALI小鼠BALF中22种蛋白明显降低和8种明显升高。GO-term和KEEG-pathway分析发现这些差异性蛋白的主要的生物学功能与免疫反应相关,其中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、CCL17和CCL22与肺泡巨噬细胞免疫功能密切相关。PCR和ELISA检测结果显示UC-MSCs治疗后,ALI小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6明显下降,IL-10、CCL17和CCL22明显升高(p0.05)。体内流式细胞术结果显示UC-MSCs治疗后ALI小鼠肺泡巨噬细胞数量减少,但是其胞内IL-10的表达增加(p0.05)。体外实验结果显示UC-MSCs干预72h后,经LPS刺激的巨噬细胞触突的数量减小,ELISA检测TNF-α表达下降和IL-10表达升高(p0.05)。结论：UC-MSCs治疗可有效调节ALI小鼠体内肺泡巨噬细胞的功能,抑制LPS刺激后肺泡巨噬细胞炎症反应的同时,促进其分泌更多的IL-10,对后续UC-MSCs治疗作用的深入研究奠定基础。第三部分UC-MSCs治疗ALI模型的旁分泌及分子机制目的：明确UC-MSCs旁分泌对ALI模型的治疗作用,并探讨其具体分子机制。方法：BABL/C小鼠随机分ALI、ALI+CM(UC-MSCs)、ALI+CM (Fibroblast) 3组,每组24只。在LPS建模1h后,ALI+CM(UC-MSCs)组、ALI+CM (Fibroblast)组分别给予80μ1 UC-MSCs和Fibroblast的浓缩条件培养基,ALI组给予80ulPBS,观察各组小鼠体重、生存率变化,24h、72h、120h处死小鼠收集标本,HE染色检测肺组织病理变化。ELISA检测UC-MSCs与LPS刺激后的巨噬细胞共培养中UC-MSCs分泌的PGE2、IL-4、IL-13的表达量。体外实验用PGE2合成关键酶特异性抑制剂Celecoxib干预UC-MSCs后收集细胞及其上清,分别与LPS诱导的巨噬细胞炎症模型共培养72h,检测巨噬细胞TNF-a和IL-10的表达。体内实验将小鼠随机分为Ctr1、AL、ALI+UC-MSCs、 ALI+UC-MSCs (-PGE2)、ALI+CM、ALI+CM (-PGE2)6组,每组24只。LPS建模1h后ALI+UC-MSCs组和ALI+CM组分别给予未经Celecoxib处理的80μl UC-MSCs细胞悬液(细胞数量0.5x10‘)和浓缩条件培养基,ALI+UC-MSCs(-PGE2)组和ALI+CM (-PGE2)组分别给予80μl经Celecoxib处理的UC-MSCs细胞悬液(细胞数量0.5x106)和浓缩条件培养基,Ctrl、ALI给予80μlPBS。观察各组体重、生存率变化,在72h处死老鼠收集标本,HE染色检测肺组织病理改变,ELISA险测BALF中TNF-a和IL-10表达变化。结果：UC-MSCs的条件培养基能够有效保护ALI模型小鼠,与ALI组比较,ALI+CM(UC-MSCs)组小鼠的体重和生存率明显提高,肺病理损伤明显降低(p0.05)；体外细胞实验检测UC-MSCs与LPS的刺激巨噬细胞共培养72h后,UC-MSCs表达的PGE2明显升高(p0.05),而IL-4、IL-13表达量没有改变。体外细胞实验PGE2被Celecoxib干预后,UC-MSCs及其条件培养基对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的调节作用都明显下降,分别与Mac+LPS+UC-MSCs组和Mac+LPS+CM组比较,Mac+LPS+UC-MSCs(-PGE2)组和Mac+LPS+CM(-PGE2)组中巨噬细胞TNF-a表达升高和IL-10表达降低(p0.05)。体内细胞实验PGE2被Celecoxib干预后,UC-MSCs及其条件培养基对ALI小鼠的保护作用都明显下降,分别与ALI+UC-MSCs组和ALI+CM组相比较,ALI+UC-MSCs(-PGE2)组、ALI+CM (-PGE2)组ALI小鼠的体重和生存率明显下降,肺组织损伤加重,BALF中细胞因子TNF-a升高和IL-10下降(p0.05)。结论：UC-MSCs主要通过旁分泌功能,尤其是分泌PGE2在UC-MSCs治疗LPS诱导的ALI动物模型中发挥治疗作用,为后续利用UC-MSCs临床治疗ALI/ARDS提供了新的机制证据。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.6;R-332
【图文】：

２．２邋ＵＣ－ＭＳＣｓ对ＡＬＩ的治疗作用：逡逑２．２．１小鼠一巧情况和生存率的改变逡逑Ｃ５７ＢＵ６ＡＬ１和ＢＡＬＢ／ＣＡＵ小鼠食董都明显减少，毛发凌乱，活动量少，对逡逑外界刺激反应慢。ＵＣ－ＭＳＣｓ治疗后，两种ＡＵ小鼠的食量增加，体重都明显上升逡逑（图１－２），对外界刺激的敏感度也明显增加。逡逑

７０Ｈ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑０逦２４逦４８逦７２逦９６逦１２０（ｈ）逡逑图１－３邋ＵＣ－ＭＳＣｓ治疗ＡＵ生存率的变化逡逑Ｆｉｇｌ－３邋Ｔｈｅ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ＡＬＩ邋ｍｉｃｅ邋ｗｉｔｈ邋ＵＣ－ＩＭＳＣｓ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ逡逑＊或者抑＾邋ｐ＜0．0５，＊＊或者＃＃代表ｐ＜０．０１逡逑＊代表邋ＡＬＩ（Ｃ巧ＢＬ化）／ＡＬＩ（Ｃ巧ＢＬ／６）＋ＵＣ－ＭＳＣｓ，抑Ｍｌ邋ＡＬＩ邋（邋ＢＡＢＬ／Ｃ）逡逑／ＡＬＩ（ＢＡＢＬ／Ｃ）＋ＵＣ－ＭＳＣｓ逡逑２７逡逑

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘宝军 ,赵艺亭 ,白桂云;急性肺损伤的诊治进展[J];医学综述;2001年12期

2 ;全球首个急性肺损伤治疗药西维来司他在日本获得许可[J];中国新药杂志;2002年07期

3 ;急性肺损伤治疗药西维来司他在日本获得许可[J];中国新药杂志;2002年12期

4 郑鹏,杨径,申群喜;沐舒坦对急性肺损伤患者保护作用的研究[J];华夏医学;2002年03期

5 陈朝辉,赵文韬;角化细胞生长因子与急性肺损伤[J];广西医学;2003年09期

6 马晓薇,曹相原;肺表面活性物质蛋白A与急性肺损伤[J];宁夏医学院学报;2004年03期

7 赵中江,孟新科,杨径;沐舒坦对急性肺损伤肺保护作用的研究[J];中国现代医学杂志;2004年22期

8 王殿华,刘旭,凌亦凌;中性粒细胞弹性蛋白酶与急性肺损伤[J];国外医学.呼吸系统分册;2004年06期

9 吴穗晶,杜欣,陆泽生,钟立业,龙怡;粒细胞集落刺激因子动员外周血造血干细胞致急性肺损伤1例[J];白血病.淋巴瘤;2004年06期

10 顾怀金;;无创正压通气治疗急性肺损伤1例[J];国外医学.呼吸系统分册;2005年12期

相关会议论文 前10条

1 武庆平;金胜威;刘东;桂平;尚游;冯丹;姚尚龙;;急性肺损伤研究新思路抗炎和促炎症消退相结合[A];2010中华医学会全国麻醉学术年会论文汇编[C];2010年

2 祝胜美;张红刚;;输血相关性急性肺损伤[A];2004年浙江省麻醉学学术年会论文汇编[C];2004年

3 张寒钰;谢苗荣;;输血相关性急性肺损伤及其新进展[A];第十一次全国急诊医学学术会议暨中华医学会急诊医学分会成立二十周年庆典论文汇编[C];2006年

4 蒋龙元;;抗凝、抗炎双向调节治疗在急性肺损伤的应用前景[A];《中华急诊医学杂志》第八届组稿会暨急诊医学首届青年论坛论文汇编[C];2009年

5 高冬娜;张_g;;急性肺损伤研究进展[A];2009年全国危重病急救医学学术会议论文汇编[C];2009年

6 梁子敬;黄伟青;;表皮生长因子对内毒素型急性肺损伤的作用实验研究[A];第五届全国灾害医学学术会议暨常州市医学会急诊危重病及灾害医学专业委员会首届年会学术论文集[C];2009年

7 潘鹏飞;于湘友;;侧卧位通气对急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征患者肺复张容积的影响[A];第三届重症医学大会论文汇编[C];2009年

8 伍峻松;王沈华;周文;陈金明;张茂;徐少文;干建新;赵小纲;;严重创伤合并急性肺损伤恶化进展至急性呼吸窘迫综合征的临床危险因素分析[A];第七届全国创伤学术会议暨2009海峡两岸创伤医学论坛论文汇编[C];2009年

9 高冬娜;张_g;;核因子-κB与急性肺损伤治疗[A];2010全国中西医结合危重病、急救医学学术会议论文汇编[C];2010年

10 胡宗风;孙海晨;邵旦兵;李百强;聂时南;;急性肺损伤血管内皮保护作用的临床研究[A];中华医学会急诊医学分会第十三次全国急诊医学学术年会大会论文集[C];2010年

相关重要报纸文章 前9条

1 熊学莉邋通讯员 曾理;急性肺损伤早诊早治降低病死率[N];健康报;2008年

2 郭姜宁 常亮 王晓静;高海拔地区急性肺损伤防治难题攻克[N];科技日报;2003年

3 郭姜宁 常亮 王晓静;急性肺损伤防治难题攻克[N];医药导报(中药报);2003年

4 ;Ｃａｌｆａｃｔａｎｔ在儿科急性肺损伤中的疗效[N];医药经济报;2005年

5 张国民;首个治疗“非典”新药进入临床研究[N];中国医药报;2003年

6 记者 张晓松;治非典新药首次获批临床试验[N];新华每日电讯;2003年

7 邹争春 记者 陈磊;我国学者发现新生儿急性肺损伤新病因[N];科技日报;2013年

8 李山;德发现致命性输血并发症致病机理[N];保健时报;2010年

9 李山;德找到致命性输血并发症致病机理[N];科技日报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 郭亮;ANGPTL4在LPS诱导的急性肺损伤中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2015年

2 宫国华;三唑类化合物的合成及心房应力调节和抗炎作用研究[D];延边大学;2015年

3 孙建斌;双链核糖核酸（dsRNA）的产生及其调控的信号通路在急性肺损伤发生发展中的分子机制研究[D];第四军医大学;2015年

4 苏玉杰;保肺解窘合剂治疗脓毒症致急性肺损伤的临床研究[D];成都中医药大学;2015年

5 张勇;褪黑素通过抑制NLRP3炎性小体减轻小鼠急性肺损伤[D];中国农业大学;2016年

6 祝华;脐带间充质干细胞治疗急性肺损伤模型的机制探讨[D];重庆医科大学;2015年

7 朱耀斌;部分液体通气技术治疗急性肺损伤的实验研究[D];中国协和医科大学;2010年

8 刘东;过氧化物酶体增殖物激活受体γ在内毒素致急性肺损伤中的保护作用及机制[D];华中科技大学;2006年

9 吴海青;间充质干细胞对内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺保护作用及机制研究[D];南方医科大学;2012年

10 宋琳;携带缺氧诱导有丝分裂因子的骨髓间充质干细胞对急性肺损伤的作用研究[D];复旦大学;2008年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘安;间充质干细胞在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中的研究进展[D];蚌埠医学院;2013年

2 何鑫敏;氦氧通气对急性肺损伤病人的治疗作用及机制[D];福建医科大学;2015年

3 任鸿昌;MMP-9、AQP-1、AQP-5在胰蛋白酶导致的急性肺损伤中的表达及意义[D];安徽医科大学;2015年

4 宣国平;Ang2在急性肺损伤中的作用及其机制研究[D];安徽医科大学;2015年

5 侯林义;抗CD14单克隆抗体对脓毒症急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞内NF-κB(p65)影响的研究[D];山西医科大学;2015年

6 冯迪;PPAR γ通路参与电针预处理对急性肺损伤的保护作用及相关机制[D];苏州大学;2015年

7 焦艳;PGC-1α在急性肺损伤中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2015年

8 庄佩佩;LPS诱导小鼠急性肺损伤及MgSO_4对其保护作用机制的研究[D];宁夏大学;2015年

9 江伟哲;右美托咪定对大鼠急性肺损伤时肺组织NF-κB活性及细胞因子的影响[D];四川医科大学;2015年

10 李君;原儿茶酸对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用[D];滨州医学院;2014年

本文编号：2730228