红背叶根醇提物的药效学及化学成分的初步研究

发布时间：2020-06-26 14:39

【摘要】：研究背景肝纤维化(Hepatic fibrosis)是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(ECM)的增生与降解失去平衡,进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程。轻者称为“纤维化”,重者肝细胞坏死严重,纤维结缔组织延伸并连结,进而使肝小叶结构改建,假小叶及结节形成,形成“肝硬化”。祖国医学将其归属于“瘾瘕”“积聚”“胁痛”等范畴。肝纤维化常见病因主要有：①病毒性肝炎如乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎等导致门脉及门脉周围性炎症,肝细胞碎屑样坏死或纤维化改变；②肝吸虫导致肉芽肿性炎症及门脉阻塞性肝纤维化；③酒精性肝纤维化：肝实质细胞内脂肪(主要为甘油三酯)堆积,细胞器变性呈酒精性透明样变(嗜酸性胞浆内涵体形成)；④胆汁性肝纤维化：分为原发性和继发性两种。原发性主要为自身免疫性肝炎的慢性肝内胆汁淤积引起,还包括高丙球血症和抗线粒体抗体引起。继发性主要为胆管梗阻引起汇管区炎症造成肝纤维化；⑤代谢性疾病如肝豆状核变性(Wilson病和血色病)；⑥中毒性如四氯化碳(CCL4)、二甲基亚硝胺(DMNA)、异烟肼等；⑦心源性如慢性充血性心衰导致肝静脉淤血,肝细胞缺氧变性所致；⑧低蛋白、高血脂等营养不良导致。肝纤维化是一个动态过程,是各种慢性肝病的共同病理学基础,所以阻断或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的重要手段。肝纤维化的机制比较复杂：有炎症反应,有氧化应激,有肝细胞损伤凋亡,最主要的是肝星状细胞的活化增殖,等等。目前多数认为肝纤维化的形成是由于多种损肝因子(如病毒、酒精、脂肪等)引发正常肝细胞损伤、坏死、凋亡,炎症产生,激活Kupffer细胞分泌多种细胞因子(如’TGF-β1、TIMP-1等),在肝细胞、肝窦内皮细胞等分泌的细胞因子、脂质过氧化产物等化学递质的作用下,肝星状细胞(HSC)被激活转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)。HSC是合成细胞外基质的主要来源,正常情况下HSC是处于静止状态的,只有被激活转化为MFB,再通过自分泌和旁分泌,一方面促使MFB增殖,合成大量胶原和蛋白多糖等,导致ECM生成与沉积,另一方面通过转化生长因子-beta1 (TGF-β1)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)等也是可以诱导肝星状细胞活化,并且TIMP能抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的活性,MMPs是降解细胞外基质的主要酶,受抑制后,ECM的降解就会减少。综合以上多方面作用,肝星状细胞活化后,ECM合成增加,降解减少,则沉积在肝脏中,于是形成并加重肝纤维化的程度。鉴于纤维化发病机制复杂,对肝纤维化的治疗大致分为：①针对病因治疗：即控制原发病如抗肝炎病毒、抗血吸虫病、戒酒等；②抑制细胞外基质合成与促进其降解；③抑制肝星状细胞的活化。治疗肝纤维化的常用药物主要有：秋水仙碱；干扰素-γ；拉米夫定：核糖核酸；维生素E等。目前尚未有治疗肝纤维化的特效药物,近年来大量的基础和临床研究证明清热利湿、活血化瘀中药大多有抗肝纤维化作用,比如丹参、姜黄、川芎、青蒿、银杏等等。常用于治疗肝纤维化的中药主要的作用机理多为抑制肝星状细胞的活化、抑制脂质过氧化及促进胶原的降解达到治疗目的。红背叶根为大戟科植物红背山麻Alchornea trewioides (Benth.) Muell.-Arg.的根。别名红背娘、红帽顶(《广西中草药》),红罗裙(广州空军《常用中草药手册》)。分布于我国中部和东南、华南,通常以根、叶入药。其根味甘,性平。功效清热解毒,祛风除湿,散瘀止血,平喘,杀虫止痒。传统应用于治肠炎腹泻,痢疾,黄疸型肝炎,尿路感染和结石,肾炎,小便不利,血尿,血崩,白带,湿疹,荨麻疹,痈疮肿毒,疮疡日久不愈合等症。近代医学研究表明,红背叶根中含大量生物碱和酚性物质,具有止咳、祛痰作用,抗乙酰胆碱作用和轻度抑制金黄色与白色葡萄球菌作用。本课题组前期研究发现其水提物及水提醇沉提取的浸膏具有抗肝炎病毒和抗肝纤维化的作用,可在临床上用以治疗慢性肝炎和肝硬化。课题组的研究结果表明红背叶根可显著抑制CCL4复合因素及酒精性肝纤维化大鼠血清中TGF-β1和TIMP-1,且能显著降低血清中HA、PCⅢ、ALT、AST水平。临床应用试验表明慢性乙型肝炎患者给予红背叶根20克,水煎服,每日一次。治疗4周后,患者临床症状均有一定的改善,尤其是缓解肝区不适感较明显,患者肝功能均有不同程度改善；治疗12周后,治疗组与对照组比较,AST和改善蛋白代谢方面较为明显(P0.05)。课题组研究了红背叶根对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用,结果表明红背叶根可显著改善免疫性肝损伤小鼠的胸腺、肝脏、脾脏系数,降低血清中ALT、AST、NO的活性以及肝组织匀浆中TNF-α、IL-1β的含量,提示红背叶根对免疫性肝损伤具有显著的保护作用。红背叶根能显著降低肝纤维化大鼠全血黏度150/s切变率、30/s切变率、5/s切变率、1/s切变率、红细胞压积、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、ALT和AST,改善纤维化大鼠舌下及耳廓络脉的循环状态,从而提示“活血通络”可能是其抗纤维化的主要病机之一。更进一步研究红背叶根水提物、醇提物和红背叶根总生物碱对CCL4致小鼠肝损伤的作用机制发现：红背叶根水提物、醇提物和总生物碱均能明显降低模型小鼠血清中ALT、AST及总胆红素水平,减轻肝细胞变性、炎细胞浸润及坏死等病变,但其保肝机制及总生物碱的分离纯化有待进一步研究。本课题组前期研究了红背叶根3个有效部位,分别是石油醚有效部位,乙酸乙酯有效部位,正丁醇有效部位对Con-A诱导的小鼠急性肝损伤,可降低小鼠血清ALT、AST、TNF-α、INF-γ及肝组织MDA含量,提高肝组织SOD活力,并可改善肝脏的组织形态,其乙酸乙酯及正丁醇有效部位有体外抑制HBsAg和HBeAg作用。红背叶根乙酸乙酯有效部位体外实验还表明乙酸乙酯有效部位可以抑制HCV的复制,为抗HCV RNA表达的活性部位。并且在预实验中,我们通过对红背叶根醇提物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物对肝纤维化大鼠的作用比较得出,三种有机溶剂对肝纤维化作用均不如总醇提物效果好。这提示我们红背叶根抑制肝纤维化的作用是多种成分共同作用的结果。综合文献参考及课题组前期研究成果,我们对红背叶根中药材进行提取和分离有效部位和有效单体进行深入研究,探知其保肝作用的有效成分并探讨其起效的机制。具体实验方法拟通过体内和体外实验两部分进行。研究方法1.红背叶根醇提物的制备工艺及质量控制本课题组根据前期实验分析的核磁共振氢谱(H-NMR)和碳谱(13C-NMR),结合HPLC等方法分析,结果显示本课题组从红背叶根中所分离的单体化合物主要为为酚酸类物质与皂苷类物质。本实验研究建立了紫外分光光度法分别测定红背叶根中药材中总酚酸、总皂苷、总黄酮的含量。并采用RP-HPLC法建立了单一有效成分没食子酸的质量控制方法学,并检测了红背叶根中丁香酸、p-谷甾醇、羽扇豆醇及没食子酸乙酯等单体化合物的含量,初步探索了红背叶根药材的物质基础。还筛选了指纹图谱研究的最优系统洗脱条件。2.动物实验2.1实验动物分组动物实验分为两部分。实验一为红背叶根活性成分筛选实验。动物分组(共13组)为：空白对照组(以下简称空白组),红背叶根乙醇提取物高、中、低剂量组,正丁醇提取物高、中、低剂量组,乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组,石油醚提取物高、中、低剂量组。实验二为红背叶根乙醇提取物抗肝纤维化的机制研究。动物分组为：空白对照组(以下简称空白组)、模型组、秋水仙碱对照组及红背叶根醇提物(AE)组。2.2动物模型的制备与给药选用SPF级雄性SD大鼠,除去空白对照组外,其余各组按2mL/kg体重,腹腔注射40%CCL4花生油溶液(2：3,v/v),每周2次。正常饮食饮水,每周日称体重并记录,连续8周。正常组与模型组用生理盐水灌胃,干预组组分别给予相应药液灌胃,灌胃体积为2mL/只。2.3实验动物样品制备各组大鼠模型完成后,用10%水合氯醛麻醉大鼠(0.3ml/100g),经腹主动脉采血,4℃低温静置6小时后,3000rpm离心15分钟,分离上层血清,-80℃保存备用,用于检测血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶(ALT/AST)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、三型前胶原(PCⅢ)、四型胶原(CⅣ),以及转化生长因子betal (TGF-β1)水平、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)水平；然后取出大鼠肝脏,观察其大体形态,称肝脏湿重计算肝脏指数。并于肝左叶中部取新鲜肝脏组织后立即用10%中性福尔马林固定后进行病理切片处理(石蜡切片),HE染色及Masson染色,继而进行各种免疫组化检测(IHC),观察肝脏组织病理学变化,同时检测肝组织中alpha-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase3)的表达情况；同时取相同部位的肝脏做肝组织匀浆,用于免疫印迹实验(Western Blot analysis),检测肝组织中相关蛋白的表达改变。3.体外细胞实验3.1细胞毒性测试将正常肝细胞(L02)和人源性肝星状细胞(hHSC)分别接种于96孔板,用不同浓度的含红背叶根醇提物(AE)培养基(0.0,0.3125,0.625,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0μg/ml)培养24小时,加MTT液孵育4小时,去上清后加DMSO溶解甲擹颗粒,测OD值,计算细胞半数抑制率,确定红背叶根对正常细胞的毒性范围以及对HSC的最佳药物浓度。3.2活化hHSC模型实验用TGF-β1细胞因子诱导人源性肝星状细胞(hHSC)活化,再用含不同浓度红背叶根AE培养基孵育24小时后,收集上清液做其他检测,收集细胞爬片做免疫组化染色,收集细胞提取蛋白做Western blot。4.统计方法采用SPSS 13.0以及Graph Pad Prism 5.0软件统计分析并作图,实验结果通过均值±标准差表示。根据实验的设计不同采用不同的统计方法：各组间均数比较采用one-way ANOVA,方差齐性时采用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时采用Welch法,组间多重比较采用Dunnett's T3法；重复测量数据采用repeated measures分析统计,满足球形检验时采用Sphericity Assumed,不满足球形检验时采用Greenhouse-Geisser校正系数；相关性分析采用Spearman's rank correlation test。P0.05为有统计学差异。结果1. 以没食子酸为对照品做紫外分光光度法测得红背叶根中药材中总酚酸含量高达16.7%,以人参皂苷为对照品测得总皂苷含量达11.7%,以芦丁为对照品测得总黄酮含量是15.2%。并用反相高效液相色谱法检测了红背叶根中的没食子酸(0.98%)、丁香酸(0.92%)、β-谷甾醇(0.78%),没食子酸乙酯和羽扇豆醇因含量较低峰值过小测定值不稳定。并且以没食子酸为对照品对红背叶根建立质量控制标准及方法学研究包括：精密度试验(RSD=0.71%)、稳定性试验(RSD=1.35%)、重现性试验(RSD=0.8%)和准确度试验(RSD=1.23%)。并探索了建立红背叶根的HPLC指纹图谱的实验条件：乙醇可以作为溶解红背叶根药材的溶剂；加热回流方法比超声提取方法得到的HPLC图形分离度和饱和度更优,故以加热回流提取法为提取方法;HPLC图谱的最大吸收波长为228nnm、273nm;流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)。2.高剂量与中剂量的红背叶根乙醇提取物有保护肝细胞、降低血清转氨酶和抑制肝脏中胶原沉积的作用,并且该作用比正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取物的作用显著。低剂量正丁醇提取物也有改善转氨酶的作用,但对抑制胶原沉积作用不明显。根据实验结果,红背叶根醇提物的有效剂量至少是0.2 g/ml。3.红背叶根醇提物对正常肝细胞的毒性很小。MTT结果显示AE在10.05μg/ml浓度时对HSC则具有半数抑制作用,但对L02在20μg/ml其抑制率仅有大约0.2。可见AE对正常肝细胞的毒性非常小但对HSC敏感。用TGF-β1诱导HSC活化后再用不同浓度AE含药培养基培养,细胞western blot结果显示AE对活化的HSC的调节与浓度相关,在极低浓度(0.625μg/ml)和高于5.0μg/ml时,AE能抑制TIMP-1表达和诱导HSC凋亡,表现为Cleaved Caspase3 (CC3)的表达升高。4.CCL4腹腔注射造肝纤维化动物模型的实验方法是可靠的。经过8周注射后,模型组的大鼠出现了精神萎靡,毛发枯暗,体重下降,转氨酶升高,肝细胞脂肪变性,坏死,炎细胞浸润及条索状的纤维沉积。5.红背叶根可以抑制肝纤维化的慢性进展过程。CCL4腹腔注射8周后,模型组肝脏的三型(P=0.003)和四型(P=0.001)胶原含量明显升高,红背叶根灌胃后可以降低肝脏中的透明质酸和Ⅳ型胶原,其效果和秋水仙碱差异不大。不同时间点(即给药前、给药2周、4周、6周、8周)动物体重差异具有显著性(F=115.489,P=0.000),不同给药组间(即空白组、模型组、秋水仙碱组和红背叶根组)的差异也具有显著性(F=12.271,P=0.000),不同治疗方法与给药时间之间具有交互作用(F=8.331,P=0.000),提示不同治疗方法随时间的增加,体重变化趋势不同。进一步分析单独效应,结果显示各时间点内四组比较有显著差异性(P0.05),以模型组体重变化差异最大(P0.01)。另外,从HE染色与Masson染色结果可见红背叶根与能减轻肝脏中的胶原沉积和肝细胞变性坏死的情况。6.红背叶根可以减轻肝细胞凋亡和肝损伤。与模型组相比,红背叶根(PALT=0.001; PAST=0.001)与秋水仙碱(PALT=0.001; PAST=0.001)都可以明显地降低转氨酶水平。肝损伤后肝细胞出现肿胀,胶原沉积等,使模型组(P=0.001)红背叶根组(P=0.035)和秋水仙碱组(P=0.001)的肝脏指数明显比空白组增高,但红背叶根(P=0.233)与秋水仙碱治疗组(P=0.004)的肝脏指数均比模型组下降,而秋水仙碱组下降具有统计学意义。肝组织切片中CC3免疫组化染色显示模型组肝细胞凋亡情况明显比空白组严重(P=0.006),而使用红背叶根组(P=0.108)与秋水仙碱组(P=0.035)的CC3表达与模型组下调,秋水仙碱组下调趋势更显著,Western blot结果也显示模型组(P0.001)、秋水仙碱组(P0.001)和红背叶根组(P0.001)的CC3表达均较空白组显著增高,但红背叶根组的CC3下降与模型组相比,差异具有统计学意义(P=0.006)。7.红背叶根可以抑制α-SMA在肝脏中的表达和血清TGF-β1水平。与空白组相比,CCL4造模后模型组血清中的TGP-β1显著升高(P0.001),而红背叶根组(P=0.104)与秋水仙碱组(P=0.143)的TGF-β1水平与空白组差异不大,但红背叶根组(P0.001)与秋水仙碱组(P0.001)的TGF-β1水平与模型组相比则明显降低。肝脏中的α-SMA表达,免疫组化结果显示模型组(P=0.041)比空白组显著升高,而秋水仙碱组(P=0.221)和红背叶根组(P=0.066)的α-SMA都与空白组差异不大,提示纤维化的肝脏中HSC被激活并大量增殖。8.红背叶根可以抑制肝脏中TIMP-1的表达,促进MMP-3的释放。TGF-β1能激活HSC分泌TIMP-1,故而模型组血清中的TIMP-1水平身高,而用过秋水仙碱(P=1.000)和红背叶根(P=0.828)组则呈下降趋势,但该差异没有统计学意义。我们又对肝组织匀浆做了western blot,结果显示模型组肝脏中TIMP-1明显升高(P0.001),而秋水仙碱(P=0.001)和红背叶根组(P=0.041)中的TIMP-1比空白组明显减低,并且与模型组相比,两种药物的TIMP-1下降水平均显著(P红背叶根0.001；P秋永仙碱0.001),肝脏匀浆中的TIMP-1蛋白表达的整体趋势与血清中的TIMP-1水平大致相符。同时,模型组肝脏中MMP-3也异常升高(P0.001),但秋水仙碱组(P0.001)与红背叶根组(P=0.125)的MMP-3表达也比空白组上升,但均比模型组低(P红背叶根0.001；P秋水仙碱0.001),但红背叶根组的MMP-3水平则比秋水仙碱组高(P=0.005),并且差异具有统计学意义。结论红背叶根乙醇提取物具有保肝降酶,抑制肝纤维化的作用,其机制可能是通过抑制正常肝细胞凋亡,并抑制肝星状细胞的活化增殖和促进其凋亡,从而减少细胞外基质的合成和促进细胞外基质的分解。并且红背叶根醇提物中含有酚酸、皂苷和黄酮类物质。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284;R285
【图文】：

二、实验结果逡逑１．邋ＣＣＬ４腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型的结果。腹腔注射０：＾４后，大鼠出逡逑现毛色枯黄无光泽，萎顿懒动，活动度下降，喜好群体滕缩在一起（如图１－１邋Ａ）。逡逑各实验姐大鼠的初始体重差异性不显著，但经过ＣＣＸ４腹腔注射后，模型组、逡逑红背叶根组和秋水仙碱组的体重均比空白姐增长缓慢（图１－２）。病理结果也提逡逑示ＣＣｋ造模后的大鼠肝脏中胶原呈条索状沉巧，肝细胞脂肪变性、坏死，周逡逑围炎细胞浸润（如图１－１邋Ｂ），血清学检测也提示造模８周后大鼠外周血中的ＡＬＴ、逡逑ＡＳＴ水平和肝纤维化指标（ＨＡ、ＰＣｍ和ＣＩＶ）均显著升高（如图１－３，１－４）。逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ逦＿＿＾之逡逑Ｂ逦２００Ｘ逦４００Ｘ逡逑谓W逡逑图１－１邋ＣＣＬ４注射可ｌｉｌ造成肝纤维化动物模型。（Ａ）邋ＣＯＬ４腹腔注射后出现大鼠毛色枯黄无逡逑１６逡逑

逦博击学位论文逦逡逑图１－４各组大鼠肝纤四项结果的比较逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏ凸邋ｏｆ邋ＨＡ，ＬＮ，ＰＣＩＩＩ邋ａｎｄ邋ＣＩＶ邋山邋ｓｅｒｕｍ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑５．红背叶根不同极性洛剂萃取物对肝脏病理的影响与空白组相比，模型组与逡逑各干预组巧脏病理学均显示出大量脂肪空泡形成，肝细施坏死，肝脏结构遭到逡逑破坏，ＨＡＥ、ＭＡＥ和ＬＡＥ沮肝脏结构破坏程度较轻，可见成片的正常肝细胞逡逑结构，脂肪变性比其余组减少（图１－５）。逡逑

本文编号：2730454