秦皮药代动力学及秦皮接骨胶囊质量控制方法研究

发布时间：2020-06-28 16:31

【摘要】：秦皮是木犀科植物苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla Hance.、白蜡树Fraxinus Chinensis Roxb.、尖叶白蜡树Fraxinus szaboana Lingelsh.、宿柱白蜡树Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮。《中国药典》(2010版)记载其具有清热燥湿、收涩、明目的功能,为临床常用中药。简单香豆素是秦皮中的一类主要活性成分,具有抗癌、抗炎、抗病毒的作用。目前对秦皮体内药动学的研究仅限于少数几种成分,忽略了中药多组分的相互协同作用,难以真实反映秦皮在体内的药动学特征,而秦皮排泄动力学的研究未见报道。同样,秦皮在体内代谢研究多数集中于单体给药的代谢研究,且仅研究了几个成分的代谢物。本研究采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)技术,研究秦皮中多成分在大鼠体内的药物动力学,并对秦皮在体内的代谢物进行鉴定,为秦皮药效物质基础的阐明提供依据。秦皮接骨胶囊是一种由秦皮、川贝母、川西小黄菊、龙骨四味中药组成的藏药,具有活血散瘀、疗伤接骨、止痛的功效,常用于跌打筋骨扭伤、淤血肿痛的治疗。本研究建立了一种简单、快速、灵敏的HPLC-MS/MS方法测定秦皮接骨胶囊中5种化学成分,并对不同批次的秦皮接骨胶囊进行了质量分析与评价,为其质量控制提供了有效分析方法。第一部分基于液质联用技术的秦皮药物动力学研究目的:1建立同时测定血浆中9种香豆素类成分的HPLC-MS/MS方法,研究大鼠灌胃给与秦皮提取物后的药动学特征;2建立测定尿液和胆汁中8种香豆素类成分的HPLC-MS/MS方法,研究其排泄动力学特征。方法:1秦皮提取物的制备:将秦皮粉碎,称取200 g,加入10倍量水,煎煮提取2 h,滤出残渣,重复提取三次,每次2 h,合并提取液,减压浓缩至100 m L,得到秦皮水提物的浓度为2 g/m L。2血浆、尿液和胆汁样品的采集与预处理:大鼠灌胃给与秦皮提取物(10 g/kg)后,于不同时间点采集大鼠血浆,生物样品采用甲醇沉淀蛋白的方法进行预处理。6只大鼠灌胃给与秦皮提取物后置于代谢笼内,收集96小时内不同时间段的尿液并记录体积,采用与血浆样品相同的预处理方法,另外6只大鼠麻醉后进行胆管插管手术,收集24小时内不同时间段的胆汁并记录体积,用相同的方法进行预处理。3检测条件:液相色谱柱为Purospher STAR LPRP-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)柱,流动相为0.05%乙酸水-甲醇,梯度洗脱,流速0.8 m L/min,进样量10μL。质谱检测采用电喷雾离子源(ESI),源喷射电压:5500 V;离子源温度(TEM):650℃;雾化气(Gas1):40psi,加热气(Gas2):50 psi,帘气:25 psi;负离子多反应监测(MRM)模式。9种待测物的监测离子对分别为秦皮甲素m/z 339.1/177.0、秦皮乙素m/z 177.0/133.0、秦皮苷m/z 369.0/207.0、秦皮素m/z 207.0/191.9、东莨菪内酯m/z 191.0/175.9、异东莨菪内酯m/z 191.0/175.9、6-羟基-7,8-二甲氧基香豆素m/z 221.1/159.1、8-羟基-6,7-二甲氧基香豆素m/z 221.1/159.1、伞形花内酯m/z 160.9/133.0。以紫花前胡苷为内标。4方法学验证与药动学参数计算:对建立的方法进行方法学验证,分别考察其专属性、线性、检测限、定量限、精密度、准确度、稳定性、基质效应、提取回收率以及残留效应。根据样品测定的结果计算得每个成分每个时间点的浓度,以时间点为横坐标,浓度为纵坐标,绘制各成分的血药浓度-时间曲线。并计算每个个体的药动学参数,如:血浆浓度-时间曲线下面积(AUC0-t、AUC0-∞),最大血浆浓度(Cmax),最大血浆浓度达峰时间(Tmax)和消除半衰期(t1/2),数据由平均值±标准偏差(SD)表示。结果:1方法学验证结果:血浆中9种待测成分的标准曲线在线性范围内线性关系良好(r≥0.9971),日内、日间精密度的相对标准偏差(RSD)小于19.1%,相对误差(RE)为-10.3%-8.8%,平均提取回收率为74.3%-101.9%;尿液和胆汁样品测定的日内、日间精密度RSD14.7%,准确度RE13.7%,8种待测成分在4种不同条件下稳定性结果RE13.8%,在尿液和胆汁中的提取回收率的范围为68.6-98.9%。2药物动力学研究结果:药动学参数表明灌胃给与大鼠秦皮提取物后,各组分吸收迅速,绝大多数化合物在1 h内达到最大浓度,而9种化合物在体内的消除速率差异较大,苷类化合物消除较快,苷元的消除速度较慢,可能是由于苷在体内转化为其苷元。东莨菪内酯和异东莨菪内酯,6-羟基-7,8-二甲氧基香豆素和8-羟基-6,7-二甲氧基香豆素为两对同分异构体,具有相似的吸收行为,但消除差异较大。大鼠灌胃给与秦皮提取物后,8种化合物在尿中32 h内基本排泄完全,在胆汁中18 h内基本排泄完全。大多数香豆素以原型在尿液中的排泄量小于10%,而秦皮乙素以原型在尿液中的排泄量达到19.26%,可能是由于大量秦皮甲素在体内代谢为秦皮乙素。8种香豆素在胆汁中的排泄量均小于2%,说明各成分以原型在大鼠胆汁中排泄率不高。结论:本研究建立了HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆、尿液和胆汁中的简单香豆素,该方法简单、快速、灵敏度高、专属性强,适用于秦皮在大鼠体内的药物动力学研究。对秦皮中香豆素类成分的排泄动力学特征以及6种香豆素(秦皮苷、秦皮素、异东莨菪内酯、6-羟基-7,8-二甲氧基香豆素、8-羟基-6,7-二甲氧基香豆素和伞形花内酯)在血浆中的药动学特征属首次研究。第二部分HPLC-QTOF-MS/MS技术鉴定秦皮中成分在大鼠血浆、尿液、胆汁中的代谢物目的:建立灵敏、有效的HPLC-QTOF-MS/MS方法,用于鉴定大鼠血浆、尿液和胆汁中秦皮成分的代谢物。方法:取SD雄性大鼠9只,分别按10 g/kg灌胃给与秦皮提取物,3只用于分段收集给药后72 h内的尿液,3只用于采集12 h内不同时间点的血浆样品,3只用于分段收集胆管插管后24 h时间段的胆汁。生物样品采用3倍乙酸乙酯萃取3次,合并上清液蒸干后,甲醇复溶。色谱柱:Purospher STAR LP RP-C18(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温:25℃,流动相:甲醇(A)-0.05%乙酸水溶液(B),梯度洗脱,洗脱程序如下:0-5 min,5-20%(A);5-20 min,20%(A);20-40min,20-40%(A);40-75 min,40-95%(A),预平衡10 min,柱温:30℃,流速:1.0 m L/min,进样量10μL。采用HPLC-QTOF-MS/MS技术进行TOF-MS-IDA-8MS/MS扫描,分别在正离子模式和负离子模式下进行数据采集,并用Peak View 2.0以及Metabolite pilot1.5等软件进行数据分析。根据秦皮中简单香豆素类成分的质谱裂解规律,并结合母药可能的代谢途径推测其可能的代谢产物。结果:本研究共鉴定出秦皮在大鼠体内的化合物39个,其中血浆中22个,尿液中36个,胆汁中24个。39个化合物中,原型化合物13个,代谢产物26个。结论:本法灵敏、有效,可成功应用于大鼠灌胃给与秦皮水提物后,尿液、血浆、胆汁中的代谢物结构鉴定。本实验对于阐明秦皮在体内的药效机制具有十分重要的意义。第三部分秦皮接骨胶囊质量控制方法研究目的:建立一种HPLC-MS/MS方法同时测定秦皮接骨胶囊中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、贝母甲素、贝母乙素5种化学成分,并用于秦皮接骨胶囊的质量控制。方法:1样品提取方法的考察:对直接超声提取和碱化后氯仿-甲醇回流提取两种方法分别进行了条件优化,并对最优条件下的样品提取结果进行了比较。直接超声提取方法分别优化了超声时间(30 min,45 min,60 min,75 min,90 min)、提取水溶液中甲醇比例(25%,50%,75%,100%)。碱化氯仿-甲醇回流提取法采用四因素三水平的正交试验进行条件优化,四因素三水平包括:碱化时间(A),水平(30 min,60 min,120 min);甲醇和氯仿比例(B),水平(1:1,1:2,1:4);提取溶液的体积(C),水平(25 m L,50 m L,75 m L);提取时间(D),水平(30min,60 min,90 min)。2测定条件:色谱柱为Purospher STAR LP RP-C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.3‰甲酸水溶液,梯度洗脱,分析时间13 min,质谱检测采用多反应监测(MRM)模式,ESI源,正、负离子切换模式,源喷射电压分别为5500 V和-4500 V,离子源温度为650℃。3方法学验证和样品测定:对所建立的方法进行方法学验证,分别考察方法的线性、范围、检测限、定量限、精密度、准确度和溶液稳定性,并采用验证的方法对3批秦皮接骨胶囊进行测定,比较不同批次间秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、贝母甲素、贝母乙素5种化学成分的含量差异,用于秦皮接骨胶囊的质量评价。结果:1样品提取方法:比较甲醇超声提取和氯仿-甲醇回流提取的结果,发现采用两种提取方法,贝母甲素和贝母乙素含量没有显著差异,而秦皮甲素、秦皮乙素和秦皮苷含量在采用超声提取时显著增加。此外,甲醇超声提取的方法简单、快速、易操作,因此选择甲醇超声提取的方法。2方法学验证:秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、贝母甲素、贝母乙素5种化学成分的峰面积和浓度在测定浓度范围内均具有良好的线性关系(r2≥0.9977),仪器重复性相对标准偏差(RSD)小于4.8%,日内和日间精密度的相对标准偏差分别小于7.4%和2.5%。回收率范围为89.7-121.4%,RSD小于10.8%。3样品测定结果:秦皮甲素、秦皮乙素和秦皮苷为秦皮的主要化合物。其中,秦皮甲素的含量最高,其次是秦皮苷,其含量测定结果平均值分别为7.96μg/g和6.18μg/g。秦皮乙素为4.48μg/g,比前两者含量较低。另一方面,贝母甲素和贝母乙素的含量相对较低,其中贝母乙素的含量(0.08μg/g)最低。此外,秦皮甲素、贝母甲素和贝母乙素在不同批次中含量没有显著的变化,不同批次相对标准偏差低于10%。秦皮乙素和秦皮苷的含量差异较大,批间差异RSD分别为17.4%和16.0%,这可能是由生产原料和生产过程的不同导致了不同批次之间的差异。结论:该法专属性强、灵敏度高、结果准确可靠,可用于秦皮接骨胶囊中多种化学成分含量的同时测定,为控制秦皮接骨胶囊的质量提供了有效分析方法。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285;R286.0

【参考文献】