利用PCL支架创建小鼠皮下异位骨髓模型的实验研究

发布时间：2020-08-17 08:37

【摘要】：目的:探讨如何利用多种生物制剂参与的三维PCL支架诱导人工骨髓模型建立与评价。材料与方法:一、确认新型萘醌类化合物对Wnt/β-Catenin/TCF信号通路的影响首先对结肠癌HCT116细胞和SW480细胞进行培养,在两种细胞中分别添加5μM浓度的41种萘醌类化合物,进行细胞生长抑制实验,初筛出具有较高细胞抑制作用的化合物,再次将这些化合物从低到高多种浓度进行细胞生长抑制实验和克隆形成实验,根据两种实验结果计算出各个化合物的IC_(50)值,根据实验结果的IC_(50)数值筛选出最具潜力化合物。然后进行TOP/FOP质粒转化、扩增、提取并转染到HCT116细胞和SW480细胞中对筛选出的化合物进行荧光素酶报告基因实验,得到抑制Wnt/β-Catenin通路最强的化合物。Co MFA分析,以最低能量的化合物23的构象进行构象搜索,并以此作为模板建立其他类似物以确定分子定量结合和活性的关系。经上述实验筛选,对最有价值的化合物在正常细胞中进行细胞毒性测试,根据结果将最有潜力化合物应用到整个实验的第二部分中。二、生物修饰PCL生物支架诱导异位骨髓形成及影响1)首先将MDA-MB-231/GFP细胞复苏、培养。MDA-MB-231/GFP细胞传代后铺设到含有PCL生物支架的96孔板中,48小时后显微镜下观察以确定该PCL支架适宜细胞生长。2)在或不在含有10 ng/m L的rh BMP-2的ATDC5细胞中分别添加Stem Regenin-1(SR1)、淫羊藿苷和萘醌类化合物N27。72小时后进行ALP活性测试,确定在ATDC5细胞中添加不同生物制剂后对ALP活性的影响。3)在小鼠腹部皮下埋置添加不同生物制剂的PCL支架,根据PCL支架上添加物质不同分为7组,分别为第一组(空白对照组):仅在PCL支架上添加PBS/0.1%BSA/0.1%DMSO;第二组:PCL支架上添加10μg的rh BMP-2;第三组:PCL支架上添加10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第四组:PCL支架上添加2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第五组:PCL支架上添加20μg SR1+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第六组:PCL支架上添加40μg淫羊藿苷+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第七组:PCL支架上添加40μg N27+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2。4)小鼠术后皮下埋置支架八周之后,对小鼠麻醉进行活体Micro-CT测量,确定小鼠皮下小骨形成情况。5)小鼠安乐死后取出小骨固定、脱钙、切片,进行HE染色和masson三色染色确定各组小骨内组织结构和细胞组成,并进行比较分析。6)从小鼠体内取出小骨后,反复冲洗小骨收集小骨内细胞,进行造血集落形成实验,确定新生小骨中造血祖细胞和造血前体细胞的频数。7)收集小骨内细胞,利用抗Sca-1-FITC抗体在流式细胞检测Sca-1+的细胞,确定小骨中存在HSCs。结果:一、确认新型萘醌类化合物对Wnt/β-Catenin/TCF信号通路的影响。1.筛选有效抑制结肠癌细胞的化合物41种化合物浓度在5μM时对两种细胞生长抑制百分比,筛选出所有化合物中具有较高细胞生长抑制作用(抑制率50%),进而测试它们IC_(50)值,其中化合物23和化合物27带有磺酰胺结构具有较低IC_(50)值(2μM),对HCT116细胞和SW480细胞生长具有较强抑制作用。而磺酰胺衍生物化合物24和25对SW480细胞株选择性抑制。2.代表性化合物在β-Catenin/TCF信号通路中的生物学特征筛选出的这六个化合物4、27、31和23-25,分别测定它们在SW480和HCT116细胞荧光素酶活性的抑制作用,磺酰胺化合物27表现出的最有力的抑制作用。它的IC_(50)值在SW480和HCT116细胞中分别为2.1μM和2.5μM。3.代表性的化合物在β-catenin高表达的结肠癌细胞中抑制集落形成的实验结果六种化合物(4,23,24,25,27,31)以剂量依赖的方式显著抑制集落形成,所有化合物的IC_(50)值均小于2μM(表2,图2)。其中磺酰胺结构的化合物23和27是最有效,结果显示化合物23和27的IC_(50)值在SW480细胞中分别为346n M和343n M,它们在HCT116细胞中IC_(50)值分别为390n M和348n M。4.Co MFA分析生物活性和Co MFA分析相结合展现了这些化合物初步结构与活性关系(见表1,2和图3)。(1)立体轮廓显示的主要地区(绿色)围绕2-胺类生物活性的贡献。二取代2-胺类(化合物4和32)比单取代的更有潜力(化合物3)。(2)不利的Co MFA区域(黄色)显示立体位阻效应导致生物活性降低(例如化合物11和12)。(3)蓝色的轮廓(正电性取代基分布)被分配到磺酰胺芳环附近,如果磺酰胺被携带π电子的芳香环所取代,活性可以增强(例如化合物22 vs 23-25)。(4)以萘醌为核3-氯类更具有抑制作用,3-氢类取代导致失去活性(23 vs 30,4 vs 29)。5.正常ATDC5细胞毒性实验ATDC5细胞株是小鼠成软骨细胞系,化合物23在药物浓度分别为5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM和0.3125μM时ATDC5的相对活力分别为2.85±1.49%、16.36±10.9%、89.13±3.59%、95.15±1.98%以及95.36±6.14%。化合物27在同样药物浓度时ATDC5的相对活力分别79.34±2.67%、85.57±2.55%、96.45±4.18%、98.35±1.33%以及99.37±0.53%。由此可见化合物27对正常细胞的毒性更小。二、生物修饰PCL生物支架诱导异位骨髓形成及影响。1.鉴定PCL生物支架适合细胞生长48小时后倒置显微镜下观察MDA-MB-231/GFP细胞在PCL支架上的生长情况。可见绝大部分细胞贴壁生长,形态呈较均一的梭形(见图4、图5)。2.ALP活性实验与rh BMP-2组比较,SR1+rh BMP-2组升高,P0.05。N27组和N27+rh BMP-2组比值则远远低于rh BMP-2组,P0.05。与SR1+rh BMP-2组比较,其他各组比值均低于SR1+rh BMP-2组,有统计学意义,P0.05。单纯SR1组、Icariin组和N27组间比较,P0.05,组间无显著差异。与N27+rh BMP-2组比较,SR1+rh BMP-2组、Icariin+rh BMP-2(即添加rh BMP-2的各组间比较),差异性显著,P0.05(见表3和附图6)。3.Micro-CT检测与空白对照组(Group1)比较,其他六组骨质密度均明显升高,P0.05。柱状图可见第五组增高最明显,当各组与第五组进行比较,差异性显著,P0.05。但是各组骨质含量没能达到小鼠脊柱水平,各组与小鼠脊柱密度比较时均有显著性差异,P0.05(见表4和附图8)。4.组织学染色图9A-G是第一组至第七组脱钙后HE染色结果,空白对照组(Goup1)没有新骨形成,肉眼观测各组间形成新骨有差别,其中在PCL支架上添加SR1+HA+Matrigel+rh BMP-2(即group5)形成较多新骨,其形态与PCL支架形状相似,并成包裹样结构,图10是第五组masson染色结果,图9和图10的Scale bars:500μm。图11A-C是HE染色结果,图11A是空白对照组(group1),图中可见红细胞、增生性间充质细胞以及较多血管,Scale bars:50μm。图11B-C是第五组染色结果,可见新形成的骨和各系造血细胞,其中包括巨核细胞、单核细胞、粒细胞和成熟红细胞,Scale bars:20μm。5.造血集落形成除小鼠本身骨髓标本形成各类集落最多以外,第5组位居第二。统计分析发现在CFU-GEMM中,各组与第5组比较,第5组形成CFU-GEMM数量明显高于其他各组,P0.05。在BFU-E中,各组与第5组比较,组2、组3、组4和组7明显低于第5组,P0.05。在CFU-GM中,各组与第5组比较,组2、组3和组7明显低于第5组,P0.05。在CFU-E中,与第5组比较,组5形成CFU-GEMM明显高于其他各组,P0.05(见表5和附图13)。图13A-D是集落形成过程中形成的不同集落,其中图13A是CFU-GEMM,可见在中心一簇红细胞的周围围绕着粒细胞和巨噬细胞,中心团簇由于含有较多血红蛋白化有核红细胞,中心区域呈现红色。图13B由多个BFU-E组成,同时也因为团簇中较高的血红蛋白化,团簇多呈红色。图13C是一簇CFU-GM,细胞密集的中心团簇周围散在一些细胞,里面包含了粒细胞和单核细胞/巨噬细胞。和粒细胞相比,单核细胞/巨核细胞更大也形态上更不规则。图13D是CFU-E(×10)。6.流式细胞检测对第1组和第5组形成的小骨进行流式细胞分析,并和小鼠骨髓进行对照,比较发现:group5 vs group1:12.6%vs 0.23%,P0.01;group5 vs FBM:12.6%±0.94%vs10.2%±1.21%,P0.05(附图14)。结论:1.多种生物制剂修饰PCL支架可以诱导异位骨/骨髓形成,新型异位骨髓具有类真实骨髓的造血功能。2.在PCL支架上rh BMP-2、HA、matrigel基质胶和SR1组合可形成更接近小鼠脊柱骨密度的骨质同时具有较高造血功能的类真实骨髓的人工骨髓模型。3.在结肠癌细胞中对41种萘醌类新合成的萘醌类化合物进行筛选得到具有低细胞毒性和在Wnt/β-Catenin通路上较高抑制作用的抑制剂N27,该化合物在构建人工骨髓模型中有明显抑制骨/骨髓形成的作用。4.淫羊藿苷与其他生物制剂组合在PCL支架上形成的骨/骨髓结构和功能仅次于SR1与其他制剂组合。5.通过本研究创建的三维人造骨髓模型相比其他研究技术难度低、操作简单、重复性高、易于普及,为进一步的临床和基础研究提供新途径,更为研究普及化打下坚实基础。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R318.1
【图文】：

化合物,对集,集落形成,上板

- 28 -图2是六种化合物不同浓度在SW480细胞中对集落细胞形成胞中集落形成与六种化合物剂量依赖的抑制曲线。SW480细胞列药物的浓度并孵育37°C恒温箱，7天后进行评估。相对克隆数（未添加药物）}x100%。结果为三个独立的实验进行重复，在6孔板图（B）中展示的是最有潜力的化合物23（上板）和化合物27的直观照片。这两个化合物以剂量依赖方式减少集落细胞形成制的浓度≥1.25μM。

等高线图,等高线图,叠加图,化合物

中（A）代表CoMFA等高线图，（B）代表19个候选化合物的叠加图

影像,小骨,周围组织,后组

ALP AssayrhBMP-2SR1SR1+rhBMP-2ICARIINICARIIN+rhBMP-2N27N27+rhBMP-20.00.51.01.52.02.5FoldhCangeinALPActivityIcariin 为淫羊藿苷，与 SR1+ rhBMP-2 组比较，组，P<0.05。实验结果为 3 次独立实验检测结果。附图 7：Micro-CT 影像及小骨直观图

【参考文献】