吲哚菁绿介导的荧光分子影像精准识别坏死组织的研究

发布时间：2020-08-21 07:15

【摘要】：研究背景坏死,是众多疾病发生和发展过程中常见的病理改变。坏死和各种疾病的关系可以用“如影随形”来形容。可正是由于坏死这一现象在疾病的发生和发展中过于常见和不可逆转,研究坏死组织和研究活组织比较起来,似乎价值不大。然而,“生与死”是对立统一的,只有对“死”有客观、精准的了解,才能更好的评估“生”的状态和预后。因为坏死往往是疾病恶化的一种表现,也是促使疾病恶化的原因之一。只有对坏死的程度、分布、趋势有精准的把握,才能指导医师实施有效的干预措施,实现对坏死趋势的控制和扭转,达到挽救组织、器官乃至个体生命的目的。尤其是在人体的一些重要器官(如：心、脑等),即使是微小的坏死病灶,如果没有被及时发现和干预,将产生致死性的后果。坏死可以发生于机体自身的正常组织,也可以发生在机体新生组织(最常见和重要的是恶性肿瘤组织)。对于前者而言,坏死范围的扩大或缩小,往往意味着疾病的恶化或缓解。对于后者而言,特别是恶性肿瘤内发生的坏死,不但能通过自发性坏死的程度和速度来间接评估肿瘤的恶性程度；还可以通过治疗性坏死的程度和速度来评估抗肿瘤治疗的效果。因而,无论是临床前的动物实验研究还是临床上的疾病干预治疗过程,都需要对机体组织的坏死范围、程度有一个精准的诊断和把握。对坏死的诊断,除了利用常规的临床表现来判断,更为客观的方式是通过相应的影像学技术手段来实现。然而,已有的传统影像学手段,尚难以完全满足上述的要求。通过特殊的影像学手段对机体各种坏死组织进行客观、实时、精准和全面的诊断,具有重要的科研和临床应用价值。因而,近年来的诸多研究都致力于探索出一种能实时、全面精准的评估机体坏死情况的影像学手段,以及相应的影像学介质。临床上现有的诊断坏死的方法,包括间接法和直接法。间接法是借助现有的各种影像学手段(如：DUS、CT、MRI或PET-CT等)加上血管造影剂来间接诊断缺血组织。例如：吲哚菁绿(indocyanine green, ICG)已经被作为血管荧光造影剂,用于识别缺血组织。经静脉注射后,ICG不能到达的部位,被认为是缺乏血供而可能是坏死组织。然而,缺血组织并不是一定就是坏死组织。因为在疾病演变中,有不少可逆性的缺血组织,最终可以恢复活力,而间接法造影无法判断可逆和不可逆性缺血。同时,血管造影的时间一般比较短暂,如ICG只有几分钟的时间。故而不利于在外科手术中动态、实时的观察坏死情况,不利于实现坏死组织清除的手术导航。而直接法是通过借助具有特异性靶向坏死组织的物质,实现对坏死组织的直接标定和显影,来实现比间接法更为精准的坏死诊断(如：同位素标定的金丝桃素)。然而,由于传统影像学手段的一些局限性(如：同位素释放的伽马射线成像的解析度低),使得同时实现高灵敏度的侦测坏死病灶、准确界定坏死组织和活组织的边界、持续动态的观测坏死的演进,成为了需要突破的焦点问题。荧光分子影像作为一种具有高分辨率和优异的边界界定能力的影像学手段,已经在临床和试验研究中,显示了其广泛的应用前景。然而,这种影像手段之所以还没有被很好的应用于临床的坏死组织诊断,是因为缺乏一种对坏死组织具有特异性标定的荧光物质。典型的荧光靶向性材料,是由信号源荧光物质和靶向性材料(如：抗体或肽段等)通过共价结合而合成的。虽然这种设计在临床前的试验中有效,但是由于两种分子结合后,分子量变大,不容易进入目标组织,而且这些新合成的物质,需要经过漫长的验证试验,才能通过药监局的认可,应用于临床。因而,临床很需要有一种可以在临床使用的对坏死组织具有特异性靶向能力的小分子荧光物质。这种物质将有望帮助临床医生实现高敏感性和高特异性的诊断和治疗与坏死相关的疾病。ICG是一种小分子荧光物质。它可以在一定波长的外来光激发下,释放出近红外波谱的荧光。这种荧光和可见光相比具有更优异的组织穿透能力,能更好的应用于活体成像。因而,近年来ICG广泛的被应用于动物和人体的光学成像。在此基础上,我们的实验团队首先发现了：ICG由于自身的分子结构特点,经静脉注射后,通过其在机体内与脂蛋白和磷脂的相互作用,能实现对坏死组织的靶向标定。虽然ICG已经被批准应用于临床40余年,但它的这一特性却一直未被发现和阐明。进一步的,我们通过一系列实验室的、在体的和体外的试验初步探索了ICG亲和坏死组织的机理,还改进了ICG静脉给药的方式,实现了目标信背比的大幅提高。在此基础上,通过自行改装的荧光显微镜的协助,我们实现了近红外荧光影像导航下的裸鼠坏死组织清除手术。在术中,近红外荧光信号充分显示了其高灵敏度和对坏死边界界定的精准性。综上,ICG靶向机体坏死组织的特性,结合其快速的临床转化能力,可以被广泛的应用于坏死相关疾病的诊断和更为精准的个体化治疗。材料与方法试剂：ICG采购自丹东医药有限责任公司。该药已经被批准在临床使用。胎牛血清(FBS)购买自北京生物技术公司。磷脂酰胆碱购(PC)买自Sigma北京有限责任公司。磷酸盐缓冲液(PBS)为自行配制。细胞水平的机制探索：同代的4T1乳腺癌细胞(由中国军事医学科学院赠送)用于比较游离ICG和ICG+脂蛋白(LP)分别与活细胞和坏死细胞的亲和性。通过使用无菌纯水使细胞水肿坏死。在显微镜下观察直到确认细胞水肿、破裂坏死。以1 μg/ml的浓度,将ICG分别溶解于PBS和FBS中,再将这两种溶液与活的4T1细胞一同孵育30分钟。其后用PBS液洗脱ICG和ICG+LP3次。坏死细胞碎屑经离心沉淀后,去除上清液,再分别加入上述两种溶液孵育30分钟。离心后去除上清液,加入PBS液混匀后离心,重复3次,以去除未结合的ICG。然后,将上述的活细胞和细胞碎屑在我们改造的荧光显微镜下拍摄可见光和荧光图像。上述试验均重复3次。分子水平的机制探索：ICG以1 μg/ml的浓度分别溶解于PBS和FBS液体。将ICG的PBS溶液200μl加入96孔板的第一个孔；ICG的FBS溶液200μl加入96孔板的第二个孔；第三个孔在200 nl ICG+FBS中加入饱和的PC。上述加样过程重复两次,分别加样在对应成分的下方。整个加样及测试过程环境温度均为37℃。将96孔板放置于小动物活体成像系统(IVIS)的视野内,自动拍摄其近红外荧光。动物实验：所有的动物试验均经过了南方医科大学珠江医院伦理委员会的批准。动物在拍摄影像和手术时均采用异氟烷气体麻醉。处死动物采用水合氯醛腹腔注射。动物包括Balb/c裸鼠和,Sprague-Dawley(SD)大鼠。雌性裸鼠用于建立乳腺癌模型,其余裸鼠均为雄性。ICG亲和坏死组织机制在体探索：裸鼠烧伤坏死模型和裸鼠肌肉缺血坏死模型分别由808激光器发射的激光烧灼制造和手术阻断下肢肌肉血供24小时制造。上述两种模型均给予0.5mg/kg体重的ICG静脉注射。然后在IVIS下记录各指定时间点的近红外光光强值。感兴趣区分别为后肢坏死区域和对侧肢体对称的相同区域范围的正常组织。烧伤坏死模型裸鼠在观察到第9天以后,予以处死,左侧下肢解剖后,行TTC染色(一种体外坏死组织染色法),再在荧光显微镜下拍摄可见光和荧光图像。信背比(SBR)增强试验：12只烧伤坏死裸鼠,分为两组。对照组给予一次性注射ICG2.0mg/kg体重。实验组给予间隔3小时的ICG注射,每次剂量为0.5mg/kg体重。两组同时注射完毕后,均在IVIS下测试其在四个时间点的荧光强度。感兴趣区的设定同前。自行改造的近红外荧光显微镜：采用莱卡公司生产的体视荧光显微镜,加装了普林斯顿器材有限公司的低温CCD作为荧光信号的采集设备。提示荧光显微镜可以将光路分别导向彩色相机和低温CCD。分别采集可见光和荧光图像。在动物或离体标本成相时,光圈采用F1.4；曝光时间为0.1秒。在对病理切片成像时参数采用光圈F1.4；曝光时间1.0秒。由于彩色照相机和低温CCD的视野有细微差异,我们专门设计了一套软件,以实现白光图像和荧光图像的融合。坏死边界的界定和小坏死病灶的侦测：我们建立了4T1乳腺癌自发性坏死的裸鼠模型；裸鼠大脑的部分激光烧灼坏死模型；SD大鼠的胃溃疡模型和裸鼠肝脏的部分酒精消融坏死模型。分别给予ICG注射,然后在最佳时间点(注射后24小时)将裸鼠和SD大鼠处死,取得相应标本。前两种模型的标本行TTC坏死染色；后两种模型在拍摄标本的白光和荧光图像后,再行冰冻切片机和HE染色,接着拍摄切片的荧光和白光图像。术中的荧光手术导航的临床前验证试验：3只烧伤坏死模型小鼠,于术前24小时静脉注射ICG0.5mg/kg体重。术中,先由外科医师行切痂术,再用改装后的荧光显微镜导航残余坏死组织的清除。3只耐甲氧西林金黄色葡萄球菌性裸鼠皮下脓肿模型。术前24小时给予ICG注射。术中先由外科医生手术清除脓肿。再在荧光显微镜下检测和导航残余坏死组织的清除。统计学方法：统计学软件采用GraphPad Prism 5软件。比较两组数据采用Student'st检验。SBR值描述为均数±标准差。规定P值小于0.05为差异有统计学意义。结果ICG靶向坏死组织的机理研究1、细胞水平的机理探索ICG的PBS溶液与活的4T1细胞共同孵育后,在体式荧光显微镜下,细胞均发出近红外荧光,说明ICG在水溶液中的游离状态下,能够与细胞膜表面的成分结合。ICG的PBS溶液与坏死的4T1细胞碎屑共同孵育后,在体式荧光显微镜下,所有细胞碎屑均发出近红外荧光,说明ICG在水溶液中的游离状态下,能够与不完整的细胞碎屑结合。ICG的FBS溶液与活的4T1细胞共同孵育后,在体式荧光显微镜下,活细胞均没有近红外荧光信号释放,说明ICG与脂蛋白结合后,不能与活细胞完整的脂质双分子层外表面的分子基团结合。ICG的FBS溶液与坏死细胞碎屑共同孵育后,在体式荧光显微镜下,细胞碎屑均能发出近红外荧光。说明ICG与脂蛋白结合后,能够与不完整的脂质双分子层或者细胞内成分结合。2、分子水平的机理探索在ICG+PBS组、ICG+FBS组和ICG+FBS+PC组,IVIS系统检测获得的近红外荧光强度显示：ICG+FBS+PC组的荧光强度平均值比ICG+FBS组高出105.84%,P0.001)。说明PC和脂蛋白的复合物和ICG的相互作用,明显提升了ICG的发光效率ICG靶向坏死组织的在体和体外规律的探索1、烧伤坏死模型和缺血坏死模型上的规律探索(1)ICG注射后烧伤坏死模型的荧光特点在ICG静脉注射后的24小时内,测量的5个时间点目标感兴趣区和对照感兴趣区的图像和光强值。可见在ICG注射的初期。坏死组织的光强值是低于正常组织的,但是随着时间的推移,坏死组织的荧光消减速度在逐步下降,而正常组织的荧光强度消减得更加快速。在超过6小时以后,所有时间点的坏死组织光强值都高于正常组织。同一时间点的坏死组织光强值比上正常组织光强值所获得的所谓信背比SBR的均数值,能更直观的显示：SBR从注射初期的小于1,逐步上升到24小时的约4倍。可见,正常组织的荧光消退速度远远快于坏死组织。从ICG注射后1天、5天、9天时的坏死组织和正常组织的光强值,可见坏死组织的光强值呈缓慢下降趋势,而正常组织的光强值呈相对稳定状态,有轻微下降。24小时到第9天,坏死组织和正常组织间的光强比值SBR也呈现为缓慢的下降趋势,但是即使在ICG注射9天以后,SBR仍然能达到2左右。(2)ICG注射后缺血—再灌注坏死模型的荧光特点在ICG静脉注射后的24小时内,测量的5个时间点目标感兴趣区和对照感兴趣区的图像和光强值。可见在ICG注射的初期。坏死组织的光强值就已经高于正常组织,随着时间的推移,坏死组织的荧光消减速度在逐步下降,而正常组织的荧光强度消减得更加快速。在6小时以内,正常组织内的荧光消减显著快于坏死组织。用同一时间点的坏死组织光强值比上正常组织光强值所获得的所谓信背比SBR的均数值,更直观的显示：SBR从注射初期就已经超过1,逐步上升到6小时的峰值约5倍。可见,正常组织的荧光消退速度远远快于坏死组织。ICG注射后1天、5天、9天时的坏死组织和正常组织的光强值。可见坏死组织的光强值呈缓慢下降趋势,而正常组织的光强值呈相对稳定状态,有轻微下降。坏死组织和正常组织间的光强比值SBR也呈现为缓慢的下降趋势,但是即使在ICG注射9天以后,SBR仍然能达到2左右。2、TTC坏死组织染色法结果与荧光结果的比对按前述方法进行标本处理和TTC染色后,将染色后的标本放置于我们改建的体式荧光显微镜下检测并拍摄可见光和荧光的图像。可以明显的看出,荧光影像的范围,边界和TTC染色后标本的白色部分(即坏死部分)是完全吻合的。能增强坏死组织信背比的ICG注射方法在实验组和对照组中,坏死组织的光学信号强度均大于其自身正常组织(P0.001)；但是在每个时间点,实验组的SBR均为对照组2倍以上(P0.001)；其中在注射ICG后24小时的实验组,SBR最高达值到了9.28±0.29。在不同组织器官的验证试验1、4T1乳腺癌自发性坏死模型的验证试验裸鼠4T1肿瘤坏死模型的癌肿标本经剖开后,在体式荧光显微镜下观察。发现肿瘤的中心区域有不规则的近红外荧光信号,而肿瘤内的外围区域没有明显的荧光信号。经TTC坏死染色法处理后的标本,在显微镜下,其红色区域(活组织)没有ICG荧光信号；其白色区域(坏死组织)与ICG释放的近红外荧光信号完全吻合。2、裸鼠左侧脑组织激光烧伤模型的验证试验裸鼠左侧脑组织激光烧伤模型(图5：b),经冰冻切片机剖开后,在体式荧光显微镜下观察。左侧近颅骨处有球形近红外荧光团,其他部位脑组织无荧光信号。经TTC坏死组织染色法染色后的脑标本,除左侧近颅骨处有一团块状脑组织呈现白色(坏死组织)外,其余脑组织呈红染。而近红外荧光信号与脑组织的白色区域完全吻合。3、SD大鼠胃溃疡模型的验证试验SD大鼠的胃溃疡模型在剖开胃大弯后,平铺于体式荧光显微镜下观察。经放大后仔细寻找,很难快速的定位微小溃疡病灶的位置。经近红外影像显示后,立即在全黑的胃组织背景中,显示出直径在0.6mm级别的荧光团。然后再在同一位置用可见光图像观察,发现确实有一处“火山样”的疑似病灶。其位置与荧光团所在位置一致。其后,将该标本制作成的HE染色后的病理切片,在体式荧光显微镜下检测。荧光信号所在的区域与切片组织中的坏死区域完全吻合,边界清晰。6只大鼠溃疡直径的平均值：1.0±0.3mm,其中能侦测到的最小的溃疡病灶,直径只有0.6mm。4、肝脏局部坏死模型的验证试验裸鼠的肝脏无水酒精消融坏死模型的肝脏整体标本,被放置于体式荧光显微镜下观察。近红外荧光所在的位置与与肉眼可以辨识的黄白色坏死区域在同一位置,但近红外光影像的范围要大于肉眼辨识的坏死组织范围。其后,将将该标本制作成的HE染色后的病理切片,在体式荧光显微镜下检测。结果显示：HE染色识别的坏死区域与ICG荧光的分布完全一致。甚至在一圈坏死组织环绕的一小块正常组织也没有荧光信号。术中的荧光手术导航的临床前验证试验：1、烧伤坏死模型近红外荧光导航手术在烧伤模型手术中,医师凭借肉眼在目镜直接观测下,切除烧伤痂皮。当医师主观认为坏死组织已经清除完成后。再在荧光下检视,发现仍然有荧光残余。进而在荧光导航下继续清除带有荧光的物质,直至荧光影像呈现为完全黑色影像。2、细菌性皮下脓肿模型近红外荧光导航手术在皮下脓肿模型手术中,切开皮肤,无菌棉签拭去脓液后,医师在目镜下观测,主观认为脓液已经清除完全。再用荧光图像导航,发现仍然有菲薄的一层坏死组织和正常组织贴附紧密,无法拭去。故医师在荧光导航下用金属刮匙清除全部荧光物质,直到荧光影像成为全黑状态。结论1、ICG靶向机体坏死组织的机理,经过初步探索以后结论是：ICG经静脉注射后,与血液中的脂蛋白结合,然后该复合物透过坏死周围不完整的血管内皮间隙,到达坏死组织。复合物选择性的与坏死组织中的磷脂疏水端结合,而不与正常细胞表面的磷脂亲水端结合。2、经过我们对ICG静脉注射方法的改进,即将相同剂量的ICG用更缓慢的速度注射到血液系统,能够实现让更多的ICG脂蛋白复合物进入坏死区域,进而增强坏死组织和背景间荧光强度的比值。3、以往文献报道的,ICG能够靶向肝癌以外的其他类型癌组织。这一观点和我们的试验结果间存在差异。我们的结论是ICG靶向的是肿瘤组织中的坏死组织成分。4、我们利用ICG来协助坏死组织的侦测和导航手术的方法,具有极高的敏感性和精准度。该方法可以为坏死相关疾病的诊断和治疗提供崭新的技术平台。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R63

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