核因子-κB介导小鼠ARDS中性粒细胞聚集调控机制及PDTC干预作用研究

发布时间：2020-08-26 05:32

【摘要】：研究目的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)本质是过度失控的炎症反应,众多效应细胞参与ARDS进程,而中性粒细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)是最重要的效应细胞。ARDS早期单核-巨噬细胞被激活,释放肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)、白介素-1β(interleukin-1, IL-1β)、IL-6、IL-8等促炎细胞因子,这些因子可激活PMN和内皮细胞等效应细胞,使大量PMN在肺内聚集,释放髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、氧自由基及溶酶体酶等多种炎症介质,导致肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的广泛损伤。核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)是炎症反应的关键性核转录因子,通常状态下,NF-κB以二聚体形式与核因子-κB抑制蛋白(inhibitor κB protein, IκB)结合形成NF-κB-IκB三聚体复合物,以非活性状态存在于胞浆中。其中发挥主要生理功能的是NF-κB p50/p65二聚体,NF-κB p65为其主要亚单位。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌外膜主要成分,可使IκB激酶激活致NF-κB磷酸化,IκB解离,NF-κB进入细胞核与DNA特定的κB序列结合后活化,高效诱导抗炎-促炎细胞因子、粘附分子及趋化因子的基因转录。而TNF-α、 IL-1β也可激活NF-κB。IL-10是一种主要的抗炎细胞因子,对NF-κB的活化产生抑制作用,减少促炎细胞因子的表达。粘附分子家族中与PMN活化关系最为密切的是整合素CD11b/CD18。在趋化因子的作用下,CD11b/CD18在PMN表面表达增多,并与其配体血管内皮细胞表面的细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)相互作用,参与PMN及血管内皮细胞的粘附、跨越血管内皮等病理生理过程。中性粒细胞趋化因子(cytokine induced neutrophil chemoattractant,CINC)是PMN特异性趋化因子,也是趋化因子IL-8家族的同源物。LPS、TNF-α及IL-1β的刺激可诱导巨噬细胞、肺间质细胞等效应细胞释放CINC,对PMN向肺内募集起重要作用。另一种趋化因子内皮中性粒细胞激活肽-78(epithelial neutrophil activating pep-tide-78, ENA-78)也可趋化PMN。此外,ENA-78与CDllb/CD18受体结合,会使内皮细胞内游离的Ca2+增加,致肺毛细血管通透性增加。吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)为一种抗氧化剂,是NF-κB的特异性抑制剂。PDTC通过稳定抑制蛋白IκB、增加IκB的合成、阻止IκB的磷酸化和后续降解,抑制NF-κB激活,使细胞因子、粘附分子、趋化因子的表达减少,抑制PMN等炎性细胞在肺内的聚集。本研究探讨了小鼠ARDS时NF-κB活化、促炎-抗炎细胞因子表达与PMN肺内聚集的关系；阐述肺组织粘附分子(CD11b/CD18、ICAM-1)及趋化因子(CINC、ENA-78)表达在PMN活化中的作用；研究PDTC对NF-κB的干预作用,为临床治疗ARDS提供新的思路。研究方法一、动物模型的建立及分组腹腔内注射LPS(20mg/kg)建立BALB/c小鼠ARDS模型,随机分对照组(N组)、脂多糖组(L组)、PDTC干预组(P+L组)。于LPS注射前半小时腹腔内注射PDTC (120mg/kg)来实现对小鼠ARDS的干预。NS组腹腔内注射20ml/kg的生理盐水。二、标本的采集每组小鼠于造模后2h、6h、12h及24h腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg麻醉。因所测指标无法一次取材成功,分三部分取材。第一部分：眼眶采血,取血清-80℃保存,备查细胞因子及总蛋白。随后开胸,心尖采血行血气分析；留取肺组织,取右肺以备HE染色和免疫组化染色；取左肺计算肺湿/干重比值(wet/dry weight ratio, W/D)。第二部分：收集支气管肺胞灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),离心,取上清液行细胞因子及总蛋白水平测定,收集细胞沉渣,行白细胞计数及测PMN比例。第三部分：取肺组织放入-80℃液氮中保存,备Western blot.逆转录及实时定量PCR及髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性的检测。三、检测方法及指标 1、HE染色评估肺组织病理损伤及评分；测肺通透指数(lung permeability index, LPI=BALF中蛋白/血清蛋白)及W/D;测P(A-a)02。 2、取BALF细胞沉渣,行Wright-Giemsa染色,计数白细胞总数及PMN的比例。 3、收集BALF上清液及取备用血清,ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-10的水平；应用试剂盒检测肺组织MPO活性。 4、提取肺组织总蛋白,Western blot法测定磷酸化NF-kB (phospho-nuclear fac-tor-kappa B, p-NF-κB)表达；提取胞浆及胞核蛋白,Western blot法测定胞浆及胞核NF-kBp65表达。 5、免疫组化法检测肺组织NF-kB、粘附分子(CDllb/CD18. ICAM-1)及趋化因子ENA-78表达。 6、采用逆转录及实时定量PCR (Real-time PCR)法测肺组织CINCmRNA表达强度。 7.、统计学分析：所有数据以平均数±标准差表示,采用SPSS19.0统计软件包分析。两两之间的比较采用t检验,P0.05表明差异有统计学意义,P0.01表明差异有显著统计学意义。研究结果一、一般情况 NS组小鼠呼吸平稳,解剖后肺部外观色泽粉红；L组小鼠呼吸急促,口唇发绀,解剖后肺体积增大,色泽暗红或紫红,脏层胸膜下点状、片状出血,切面淡红色液体渗出；P+L组小鼠呼吸急促减轻,解剖后肺体积无明显增大,色泽呈红色,表面见少许散在的出血点,包膜张力减轻。二、HE染色评估肺组织病理损伤及评分 1、HE染色 NS组肺组织结构完整正常；L组部分肺泡壁不同程度的破坏或断裂,肺微血管充血、出血、微血栓形成,肺泡腔及肺间质内见大量炎性细胞浸润、Ⅰ型肺泡上皮细胞坏死；PDTC干预后肺组织损伤程度减轻。 2、肺病理评分 L组肺组织病理评分明显高于NS组(P0.01)；PDTC干预后病理评分较L组下降(P0.05),病理评分与HE染色肺组织损伤的动态变化趋势相似。三、肺血管通透性变化的检测 1、肺组织湿/干重比值(W/D) L组肺组织W/D值较NS组明显增加(P0.01),随着造模时间延长W/D值逐渐增加；PDTC干预后肺水肿程度减轻,W/D值均较LS组明显下降(P0.05),但高于NS组。 2、肺通透指数(LPI) L组肺LPI较NS组明显升高(P0.01),PDTC干预后肺泡腔及肺间质内蛋白渗出减少,与L组对比,LPI下降(P0.05)。四、BALF中白细胞总数及PMN比例 L组白细胞总数及PMN比例较NS组进行性增加(P0.01)；PDTC干预后白细胞总数下降,各时相点均低于L组,2h及6h与L组对比,差异有统计学意义(P0.05),12h及24h与L组对比,差异具有显著统计学意义(P0.01)；但P+L组各时相点PMN比例与L组对比呈下降趋势,差异有统计学意义(P0.05)。五、血清及BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-10的表达 L组血清及BALF中TNF-α、IL-1β及IL-8的浓度明显高于NS组(P0.01)；PDTC干预后TNF-α、IL-1β及IL-8的浓度在2h、6h及12h低于L组(P0.05),而在24h明显低于L组,差异有显著统计学意义(P0.01),但均高于NS组。与NS组对比,L组在最初6h内血清及BALF中IL-10的浓度升高(P0.05),随着时间延长,IL-10的浓度明显升高(P0.01)；PDTC干预后,与L组比较,2h IL-10的浓度略降低,差异无统计学意义(P0.05),但6h、12h及24h IL-10的浓度低于L组,差异有统计学意义(P0.05)。六、肺组织中MPO的活性 L组肺组织MPO活性较NS组明显增加(P0.01)；PDTC干预后与L组比较,MPO活性降低(P0.05),但不能回到正常水平。七、Western blot检测肺组织p-NF-κB、胞浆及胞核中NF-κBp65蛋白的表达 L组肺组织p-NF-κB蛋白的表达增强,与NS组相比(P0.01)；PDTC干预后p-NF-κB蛋白的表达增强较L组降低(P0.05)。 L组肺组织胞浆中P65蛋白的表达强度降低,而胞核中P65蛋白表达强度升高,与NS组比较(P0.01)。PDTC干预后胞浆中P65蛋白的表达强度较L组升高(P0.05)；在2h、6h及12h而胞核中P65蛋白表达强度较L组降低,差异有统计学意义(P0.05),在24h胞核中P65蛋白表达强度较L组明显降低,差异有显著统计学意义(P0.01)。八、逆转录及实时定量PCR检测CINCmRNA的表达 NS组肺组织有极少量的CINCmRNA的表达；与NS组相比,L组CINCm RNA的表达明显增加(P0.01)；PDTC干预后肺组织CINCmRNA的表达与L组对比表达明显减少(P0.01)。九、免疫组化检测肺组织NF-κB、CD11b/CD18及ICAM-1、ENA-78的表达以细胞出现棕褐色或棕黄色着色为阳性表达。与NS组对比,L组可见较多的NF-κB阳性免疫反应的细胞,主要表达在肺间质PMN; PDTC干预后NF-κB阳性免疫反应的细胞减少。L组CDllb/CD18阳性表达的细胞较NS组明显增加,主要在PMN上表达；PDTC干预后CD11b/CD18阳性表达的细胞减少。ICAM-1主要表达在血管内皮细胞,与NS组对比,L组ICAM-1阳性免疫反应的细胞增加；PDTC干预后ICAM-1阳性免疫反应的细胞减少。与NS组对比,L组ENA-78阳性表达的细胞增加,以内皮细胞阳性表达为主；PDTC干预后ENA-78阳性表达的细胞减少。研究结论 1、LPS诱导的ARDS中,NF-κB磷酸化降解,NF-KBp65由胞浆向胞核转移,NF-κB激活,细胞因子(IL-1β、IL-8、IL-10和TNF-a).粘附分子及趋化因子表达增加。 2、小鼠ARDS早期促炎-抗炎反应失衡,表现在促炎细胞因子表达增多,抗炎细胞因子相对不足,且高表达时间滞后。 3、在趋化因子(CINC. ENA-78)的作用下,PMN表面粘附分子CD11b/CD18表达增多,与其配体内皮细胞表面的粘附分子ICAM-1相互作用,使PMN粘附在血管壁,并跨越内皮向肺组织浸润。 4、PDTC通过抑制NF-κB的激活,下调细胞因子、粘附分子及趋化因子的表达,减少PMN聚集,改善促炎-抗炎介质的失衡,使PMN释放的MPO减少,肺组织损伤减轻。创新性及意义 1、本研究系统地从肺组织p-NF-κB及胞浆、胞核p65蛋白表达阐述ADRS时NF-κB活化。 2、探讨粘附分子、趋化因子的高表达对ARDS肺组织PMN聚集的影响。 3、研究NF-κB的特异性抑制剂PDTC对ARDS小鼠的保护机制,为进一步研究其发病机制、拓展ARDS的治疗途径提供广阔的前景。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.8

【参考文献】