研究背景与目的:全身麻醉的开展距今已有160多年的历史,关于全麻机制的解释争论较多,近年来神经科学家认为:作用在大脑不同脑区、核团的全麻药物,通过特定的作用靶点调节神经递质水平,形成神经网络相互作用,使机体在麻醉-觉醒状态间进行转换。2016年PNAS杂志报道:在异氟醚麻醉下,利用光遗传技术激活小鼠中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)的多巴胺能神经元能够使其立即觉醒,VTA核团多巴胺能神经元接收来自腹外侧视前区(ventrolateral proptic nucleus,VLPO),和中缝背核(dorsal raphe nucleu DR)等核团神经纤维的投射,也能够将神经纤维投射到前额皮质区(prefrontal cortex,PFC)和伏隔核(nucleus accumbens,NAc)等核团。那么 VTA核团多巴胺能神经元是如何受到其它神经核团投射调节?又是通过对哪些核团进行调节从而介导麻醉与觉醒之间的转换,目前尚不清楚。基于以上科学问题,本研究将利用free-moving动物模型、脑内核团微注射、神经电生理以及化学遗传学等技术方法,研究在七氟醚麻醉药物诱导以及向觉醒转换过程中,神经环路中VTA核团多巴胺能神经元的作用,探讨VTA-mPFC通路多巴胺能神经元在七氟醚麻醉-觉醒中的调节作用,初步探讨其作用机制。第一部分目的:通过系统性给药、核团微注射和DREADD技术等方法研究VTA核团多巴胺能神经元在七氟醚麻醉-觉醒调控中的作用及机制。方法:实验动物:雄性SD大鼠,体重250～280g。1 系统性证实多巴胺能神经元是否参与七氟醚麻醉-觉醒过程的调控。18只SD大鼠随机分为3组(n=6):CON组、SCH组、APB组。在实验环境适应5d后进行行为学实验,所用药物均稀释到0.5ml。CON组:腹腔注射生理盐水;SCH组:腹腔注射D1受体拮抗剂SCH23390(2mg/kg);APB组:腹腔注射D1受体激动剂Chloro-APB(3mg/kg)。观察药物对大鼠七氟醚麻醉诱导及觉醒时间的影响,麻醉诱导观察指标为翻正反射消失时间,麻醉觉醒观察指标为翻正反射恢复时间。2 药理学方法证实VTA核团对七氟醚麻醉-觉醒的调控作用。60只SD大鼠随机分为5组(n=12):CON组、MK-801 组、SCH组、Bicu(Bicuculline)组、DMSO组。实验前进行VTA核团微注射导管埋置和脑电电极植入,恢复5d后每组随机抽取6只大鼠VTA核团注射相应药物0.3μL。CON组:注射生理盐水;SCH组:注射D1受体拮抗剂SCH23390(5mg/ml);Bicu组:注射GABAA受体拮抗剂Bicuculline(2.5mg/ml);MK-801 组:注射NMDA受体拮抗剂MK-801(0.6mg/ml);DMSO组:作为Bicu组的对照组(DMSO为Bicuculline的有机溶剂)。注药15min后开始麻醉观察药物对七氟醚麻醉诱导时间的影响。每组其余6只大鼠,则于麻醉开始后15min注药,观察药物对麻醉觉醒时间的影响。3 采用DREADD技术证实特异性激活VTA核团多巴胺能神经元对七氟醚麻醉-觉醒的影响。12只大鼠随机分为2组(n=6):hM3Dq组和CON组。hM3Dq组:VTA核团注射含hM3Dq的重组腺相关病毒(rAAV-DIO-hM3Dq-mCherry);CON组:VTA核团注射不带有hM3Dq但其它病毒元件与实验组一致的“空病毒”(rAAV-DIO-mCherry)作为对照。恢复28d后,两组动物均给予腹腔注射CNO,观察特异性激活VTA核团多巴胺能神经元后对大鼠麻醉诱导与觉醒时间的影响。结果:1 大鼠腹腔注射D1受体拮抗剂SCH23390后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间明显缩短(P0.01),觉醒时间明显延长(P0.01);腹腔注射D1受体激动剂Chloro-APB后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间明显延长(P0.01),觉醒时间明显缩短(P0.05)。2 大鼠VTA核团给予NMDA受体拮抗剂MK-801后与CON组比麻醉诱导时间明显缩短(P0.01),觉醒时间明显延长(P0.01);VTA核团给予D1受体拮抗剂SCH23390后与CON组比麻醉诱导时间明显缩短(P0.01),觉醒时间明显延长(P0.01);VTA核团给予DMSO后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间及觉醒时间无明显差异(P0.05);VTA核团给予GABAA受体拮抗剂Bicuculline与DMSO组比麻醉诱导时间明显延长(P0.05),觉醒时间明显缩短(P0.05)。3 大鼠经过核团微注射病毒及腹腔注射CNO,特异性激活VTA核团多巴胺能神经元后,hM3Dq组与CON组相比七氟醚麻醉诱导时间延长(P0.05),觉醒时间显著缩短(P0.01)。第二部分目的:通过核团微注射和DREADD技术研究VTA-mPFC通路在七氟醚麻醉-觉醒调控中的作用及机制。方法:实验动物:雄性SD大鼠,体重250～280g。1 药理学方法证实mPFC区多巴胺能神经元对七氟醚麻醉-觉醒的调控作用。36只大鼠随机分为3组(n=12):CON组、SCH组、APB组。实验前进行微注射导管埋置,恢复5d后每组随机抽取6只大鼠,mPFC区微注射药物0.5μL,CON组:注射生理盐水;SCH组:注射D1受体拮抗剂SCH23390(5mg/ml);APB组:注射D1受体激动剂Chloro-APB(6mg/ml)。注药15min后开始麻醉,观察药物对七氟醚麻醉诱导时间的影响。每组其余6只大鼠,则于麻醉开始后15min注药,观察药物对麻醉觉醒时间的影响。2 药理学方法证实VTA-mPFC通路对七氟醚麻醉-觉醒的调节作用。48只大鼠随机分4组(n=12):CON组、VTA-Bicu(Bicuculline)组、mPFC-SCH组、Bicu/SCH组。实验前进行微注射导管埋置,恢复5d后每组随机抽取6只大鼠VTA核团与mPFC区注射相应药物,药物浓度分别为Bicuculline(2.5mg/ml)、SCH23390(5mg/ml)。CON组:VTA核团注射Bicuculline的有机溶剂DMSO 0.3μL,mPFC区注射0.5μL生理盐水;VTA-Bicu组:VTA核团注射GABAA受体拮抗剂Bicuculline 0.3μL,mPFC区注射生理盐水0.5μL;mPFC-SCH组:VTA核团注射DMSO 0.3μL,mPFC区注射D1受体拮抗剂 SCH23390 0.5μL;Bicu/SCH组:VTA核团注射Bicuculline 0.3μL,mPFC区注射SCH23390 0.5μL。注药15min后开始麻醉,观察各种药物对七氟醚麻醉诱导时间的影响。每组其余6只大鼠,则于麻醉开始后15min注药,观察药物对麻醉觉醒时间的影响。3 DREADD技术证实VTA-mPFC通路多巴胺能神经元对七氟醚麻醉-觉醒的主要作用。12只大鼠随机分为2组(n=6):hM3Dq组和CON组。hM3Dq组:VTA核团注射含hM3Dq的重组腺相关病毒(rAAV-DIO-hM3Dq-mCherry);CON组:VTA核团注射不带有hM3Dq但其它病毒元件与实验组一致的“空病毒”(rAAV-DIO-mCherry)作为对照组。恢复28d后,两组动物均在mPFC区注射CNO,观察VTA-mPFC通路多巴胺能神经元激活后对大鼠的麻醉诱导与觉醒时间的影响。结果:1 nPFC区注射D1受体拮抗剂SCH23390后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间显著缩短(P0.01),麻醉觉醒时间显著延长(P0.01);mPFC区注射D1受体激动剂Chloro-APB后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间显著延长(P0.01),觉醒时间显著缩短(P0.01)。2 VTA核团注射Bicuculline后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间延长,麻醉觉醒时间缩短(P0.01);mPFC区注射SCH23390后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间缩短,麻醉觉醒时间延长(P0.01);而VTA核团注射Bicuculline同时mPFC区注射SCH23390与CON组比差异无统计学意义(P0.05)。3 hM3Dq组与CON相比,特异性激活VTA-mPFC通路多巴胺能神经元后,七氟醚麻醉诱导时间显著延长(P0.01),麻醉觉醒时间显著缩短(P0.01)。结论:本研究证实了VTA核团多巴胺能神经元及其受体活性变化可以对七氟醚麻醉-觉醒产生影响,这些结果提示VTA核团多巴胺能神经元在全麻作用机制的神经网路中发挥重要作用,并且VTA-mPFC通路多巴胺能神经元在麻醉-觉醒的调节中发挥重要作用。
【学位单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R614
【部分图文】：
白质学说”此前他们的研究证实，麻醉药物可以与细胞膜上的特定受体、通道蛋白等逡逑相互作用，认为全麻药物是作用于特定离子通道或蛋白质发挥作用［３］。但是，近年来逡逑神经科学家认为：在大脑不同脑区、核团的全麻药物，通过特定的作用靶点调节神经逡逑递质水平，形成神经网络相互作用，使机体在麻醉－觉醒状态间进行转换。麻药物引逡逑起的可逆性意识消失与恢复（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ邋ｏｆ邋ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｎｅｓｓ，邋ＲＯＣ）的全麻机制研究有助于逡逑信号处理和人类认知功能的研究［４］。异氟醚、七氟醚［５，６］等吸入麻醉剂和静脉麻醉药丙逡逑泊酚［７］通过网状上行激活系统相关的丘脑、中脑等结构区域，最终作用于大脑皮质产逡逑生抑制作用，发挥麻醉效应。在这些神经网络中，一些重要的核团和脑区，如中缝背逡逑核（ｄｏｒｓａｌ邋ｒａｐｈｅ邋ｎｕｃｌｅｕｓ，邋ＤＲ）｜８］，腹外侧视前区（Ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ邋ｐｒｅｏｐｔｉｃ邋ｎｕｃｌｅｕｓ，邋ＶＬＰＯ）［９］，逡逑穹隆周（ｐｅｒｉｆｏｍｉｃａｌ，Ｐｅｆ）［１Ｑ］等网络调控中的关键核团，参与麻醉－觉醒调控（图１）为逡逑全麻药物作用机制的神经网络调控学说提供了强有力的证据。这些相互关联的核团通逡逑过神经纤维投射，形成了多个相互调控相互作用的神经回路［３，１１］。逡逑
变导致大鼠应激对实验结果造成影响，麻醉圆筒进气端连接小动物放有碱石灰避免Ｃ0２重复吸入，出气端连接废气回收装置，麻醉圆筒恒温毯，保持圆筒内温度在２４±０．５°Ｃ，吸入３０％氧气，流量２Ｌ／ｍｉｎ。物，生理盐水稀释所用药物用到0．５ｍｌ，邋Ｃｈｌｏｒｏ－ＡＰＢ置于超声水浴箱ＯＮ组：注射生理盐水０．５ｍｌ；邋ＳＣＨ组：注射ＳＣＨ２３３９０邋（２ｍｇ／ｋｇ）；邋ＡＰｌｏｒｏ－ＡＰＢ邋（３ｍｇ／ｋｇ）。注射药物前进行回吸，回吸无血后再进行推注，１。逡逑七氟醚麻醉并计时，输出浓度为２．４％。待大鼠意识消失后，每１５ｓ转动鼠处于异常体位时不能主动恢复正常体位（即四肢着地位）并且１５ｓ翻正反射消失，此时间记为ＬＯＲＲ时间。逡逑第３０ｍｉｎ关闭挥发罐，停止七氟醚麻醉，观察大鼠翻正反射是否恢复，位时，能主动恢复正常体位，认为其翻正反射恢复，此时记为ＲＯＲＲ图２。逡逑ＬＯＲＲ逦ＲＯＲＲ逡逑
逑单位青霉素肌肉注射预防感染，术后将大鼠单笼饲养，自由进食水，恢复５ｄ后药理学逡逑方法证实，ＶＴＡ核团对七氟醚麻醉－觉醒的调控作用。微注射导管埋置流程如图３。逡逑ｍｍ逡逑ｍ逡逑图３：图为大鼠埋置微注射导管流程。逡逑２．２．３药理学方法证实ＶＴＡ核团对七氟醚麻醉－觉醒调控作用的实验方法逡逑１）
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2809242
