AQP4和AQP1的动态表达在小鼠蛛网膜下腔出血后脑水肿及脑积水中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-30 13:38

　　 背景和目的蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种高病死率和持久性的全球健康难题。虽然诱发SAH的因素有多种,但脑动脉瘤破裂引发的SAH占SAH总数的75%-85%。SAH出血后,可能引起患者出现嗜睡、混乱、局灶性神经功能缺损、偏瘫,甚至昏迷等,严重威胁患者健康和生活质量。从病理机制方面研究SAH并发症的发生机制,将有益于SAH病发后患者的治疗和预后。SAH发生后引起机体神经功能缺损往往诱发一些大脑病理机制的发生,如脑积水、内皮细胞和神经细胞凋亡、大脑水肿、血脑屏障消失、大脑调节机制异常、血栓形成等等。其中脑水肿和脑积水的发生对神经功能损伤造成了深远的影响。在脑水肿和脑积水发生过程中,水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)的作用至关重要。AQP1和AQP4是中枢神经系统中最主要的两种水通道蛋白。已有研究表明AQP1或者AQP4与肿瘤性脑水肿、脑创伤、中风及AQP4基因敲除引发脑积水有一定关联性。但已有的研究表明,AQPs的表达可能在脑积水的形成过程中起到一种反馈和代偿机制,且大多都是基于AQP4基因敲除大鼠或者先天性脑积水、诱发的脑积水模型进行研究而得出的结论。而基于正常小鼠(未进行AQP1、AQP4基因敲除)SAH后水通道蛋白的动态变化以及水通道蛋白与脑积水关系,国内外目前无相关报道;而且亦少有文献报道SAH引起脑水肿的病理生理与水通道蛋白的关系。另外,在各种生理或者病理生理条件下,AQP1和AQP4蛋白水平的变化是可以被调控的。虽然证据指出多种机制参与AQP1和AQP4表达水平的调控过程,但具体的调节机制尚未完全明确。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)包括ERK1和ERK2,是属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路中的一个通路,其磷酸化活化状态在调控脑损伤、星形胶质细胞膨胀、脑血屏障损伤等过程中发挥重要作用。而且,在其它神经细胞中,ERK1/2信号通路的激活与AQP1或者AQP4的表达存在一定关系。然而,ERK1/2调控AQP1或者AQP4是否参与SAH引发脑水肿的过程尚未可知。因此,本课题将通过建立正常小鼠的SAH模型,探讨脑水肿和脑积水形成过程中,AQP1和AQP4的动态表达变化。并通过阻断ERK1/2信号通路,探讨ERK1/2对AQP1、AQP4表达的调控及其对SAH并发性病理状态的影响。第一部分AQP4和AQP1在蛛网膜下腔出血后急性期脑水肿中的作用材料与方法1.实验分组及模型建立:体质量为28-32 g的雄性健康昆明小鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组和SAH手术组(SAH组),SAH组又分为术后8h、16h、24h和3d四个亚组。采用自体血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型,正常对照组小鼠经相同的手术过程,但未作任何处理;假手术组小鼠也经相同的手术过程,但不注入自体血,而是注入等渗生理盐水。2.检测指标及方法:每组各8只小鼠麻醉醒后,对其进行神经功能评分,然后利用干湿法测定小鼠脑组织水含量;通过伊文思蓝(EB)溶液对每组各8只小鼠血脑屏障的通透性进行血脑屏障通透性测定;在每组各8只小鼠额部脑皮质和额角脉络丛、矢状窦处提取标本,通过荧光定量PCR和Western Blot检测脑皮质和室周中AQP4表达以及脉络丛和室周中AQP1表达。3.统计分析:采用SPSS 13.0统计学软件分析。所有数据均以均数±SD的形式表示。组间比较用单因素方差分析,各组均数间比较采用q检验。P0.05为差异有统计学意义。结果1.与Sham组相比,SAH急性期术后不同时间点(8h、16h、24h和3d)组小鼠均出现神经功能受损,且在术后8 h时受损最严重,随着时间的延长,神经功能逐渐恢复,但仍低于Sham组;SAH小鼠脑组织含水量和血脑屏障通透性在术后不同时间点(8h、16h、24h和3d)均较Sham组显著升高(P0.05),且在术后24h达到峰值,术后3 d较术后24 h相比,脑组织含水量和血脑屏障通透性均下降。2.Real-time PCR和western blot结果显示SAH急性期术后不同时间点(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠皮质和室周AQP4 m RNA和蛋白表达水平分别较Sham组小鼠上调,且术后8 h、16 h和24 h小鼠皮质和室周AQP4表达量逐渐升高,在术后24 h达到峰值,术后3 d较术后24 h相比,皮质和室周AQP4表达量均下调。3.Real-time PCR结果显示SAH急性期术后不同时间点(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠脉络丛AQP1 m RNA表达水平较Sham组下调,术后8 h、16 h和24 h脉络丛AQP1 m RNA表达量逐渐下调,在术后24 h降至最低值,术后3 d较术后24 h相比,脉络丛AQP1 m RNA表达量上调;western blot结果提示术后8 h、16 h和24 h小鼠脉络丛AQP1蛋白表达较Sham组略有下降。SAH术后不同时间点(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠室周AQP1 m RNA和蛋白表达量较Sham组均上调,且随着时间的增加,于术后24 h达到最高峰,术后3 d较术后24 h小鼠相比,室周AQP1表达下调。第二部分AQP4和AQP1在蛛网膜下腔出血后慢性期脑积水中的作用材料与方法1.实验分组及模型建立:将SAH小鼠分为无脑积水组和脑积水组,两组小鼠又进一步细分为术后1周、2周和4周各3个亚组。采用自体血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型。2.检测指标及方法:每组各8只小鼠麻醉醒后,对其进行神经功能评分,并利用干湿法测定小鼠脑组织水含量;通过EB溶液对每组各8只小鼠血脑屏障的通透性进行血脑屏障通透性测定;在每组各8只小鼠额部脑皮质和额角脉络丛、矢状窦处提取标本,通过荧光定量PCR和Western Blot检测脑皮质和室周中AQP4表达以及脉络丛和室周中AQP1表达。3.统计分析:采用SPSS 13.0统计学软件分析。所有数据均以均数±SD的形式表示。组间比较用单因素方差分析,各组均数间比较采用q检验。P0.05为差异有统计学意义。结果1.SAH慢性期术后不同时间点(1周、2周和4周)相比,无脑积水组和脑积水组小鼠神经功能均无统计学差异(P0.05),随着时间的增加,无脑积水组小鼠脑组织含水量和血脑屏障通透性没有变化,而脑积水组脑组织含水量和血脑屏障通透性均逐渐增加;脑积水组与非脑积水组相比,不同时间点(1周、2周和4周)小鼠神经功能均显著下降(P0.05)而脑含水量均显著升高(P0.05),术后1周两组小鼠血脑屏障通透性无显著差异(P0.05),术后2周和4周脑积水组小鼠血脑屏障通透性较非脑积水组显著增加(P0.05)。2.Real-time PCR结果显示无脑积水组小鼠室周和皮质AQP4 m RNA表达在SAH慢性期术后不同时间点(1周、2周和4周)无差异,而脑积水组随着术后时间的增加,AQP4 m RNA表达逐渐上调;脑积水组与非脑积水组相比,术后1周小鼠室周和皮质AQP4 m RNA表达无显著差异(P0.05),术后2周和4周表达均显著增加(P0.05)。Western blot结果显示术后1周和2周,小鼠室周AQP4蛋白表达在脑积水组与非脑积水组中均无差异,而皮质AQP4蛋白表达在脑积水组中略有下降,术后4周,小鼠室周和皮质AQP4蛋白在脑积水组中较非脑积水组中均显著上调(P0.05)。3.Real-time PCR结果显示无脑积水组小鼠脉络丛和室周AQP1 m RNA表达在SAH术后不同时间点(1周、2周和4周)的差异无统计学意义(P0.05),而脑积水组中,随着术后时间的增加AQP1 m RNA表达也增加;脑积水组与非脑积水组相比,术后1周和2周时,小鼠脉络丛和室周AQP1 m RNA表达下调,术后4周AQP1 m RNA表达显著上调(P0.05)。Western blot结果显示术后1周脑积水组小鼠脉络丛和室周AQP1蛋白表达较无脑积水组均下调,脉络丛AQP1蛋白在术后2周和4周表达无差异,室周区域在术后2周表达无差异,术后4周在脑积水组表达上调。第三部分AQP4和AQP1在蛛网膜下腔出血后不同程度脑积水中的作用材料与方法1.实验分组及模型建立:将SAH术后4周的小鼠根据核磁共振(MRI)结果分为轻度、中度、重度脑积水组。采用自体血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型。同等数量的无脑积水SAH小鼠为对照。2.检测指标及方法:MRI检测脑室大小及脑积水的程度;每组各8只小鼠麻醉醒后,对其进行神经功能评分,及利用干湿法测定小鼠脑组织水含量;通过EB溶液对每组各8只小鼠血脑屏障的通透性进行血脑屏障通透性测定;在每组各8只小鼠额部脑皮质和额角脉络丛、矢状窦处提取标本,通过荧光定量PCR和Western Blot检测脑皮质和室周中AQP4表达以及脉络丛和室周中AQP1表达。3.统计分析:采用SPSS 13.0统计学软件分析。所有数据均以均数±SD的形式表示。组间比较用单因素方差分析,各组均数间比较采用q检验。P0.05为差异有统计学意义。结果1.根据小鼠侧脑室/脑组织宽度比值将SAH脑积水小鼠分为轻度、中度和重度三个组。与对照组相比,SAH不同程度脑积水小鼠神经功能均显著下降(P0.05)、脑含水量和血脑屏障通透性均显著增加(P0.05),且随着脑积水严重程度的增加,神经功能逐渐下降、脑含水量和血脑屏障通透性逐渐上升。2.Real-time PCR和western blot结果显示SAH不同程度脑积水组与对照组相比,小鼠室周和皮质AQP4 m RNA和蛋白表达水平均上调,且随着脑积水严重程度的增加,AQP4 m RNA和蛋白表达逐渐增加。3.Real-time PCR和western blot结果显示SAH不同程度脑积水组与对照组相比,小鼠脉络丛和室周AQP1 m RNA和蛋白表达水平均上调,且随着脑积水严重程度的增加,AQP1 m RNA和蛋白表达逐渐增加。第四部分AQP4和AQP1在蛛网膜下腔出血后急性期的可能机制材料和方法1.实验分组:小鼠分为假手术组、SAH+U0126组和SAH+vehicle组。SAH+U0126组是于SAH处理后脑池注射ERK通路阻断剂U0126(U0126溶于0.1%DMSO中,并以0.20μg/Kg体质量对小鼠进行脑池注射),于SAH后8 h,16 h,24 h连续给药,并于SAH后3 d对小鼠进行神经行为学评分、脑含水量、血脑屏障和相关蛋白等进行检测。SAH+vehicle组小鼠处理时间与SAH+U0126组相同,只是注射0.1%DMSO(溶于生理盐水)。2.检测指标及方法:每组各8只小鼠麻醉醒后,对其进行神经功能评分,并利用干湿法测定小鼠脑组织水含量;通过EB溶液对每组各8只小鼠血脑屏障的通透性进行血脑屏障通透性测定;Western Blot检测每组各8只小鼠室周中ERK、AQP1、AQP4的表达。3.统计分析:采用SPSS 13.0统计学软件分析。所有数据均以均数±SD的形式表示。组间比较用单因素方差分析,各组均数间比较采用q检验。P0.05为差异有统计学意义。结果1.Western blot结果显示小鼠室周p ERK蛋白表达在SAH术后不同时间点(8h、16h、24h和3d)较Sham组均显著上调(P0.05),且随着术后时间的增加,于术后24h达到表达最高峰,术后3d与24h相比,室周区域p ERK蛋白表达下调。Peason相关性分析显示SAH术后小鼠室周p ERK分别和AQP1及AQP4蛋白表达呈显著正相关(r=0.384,P0.05;r=0.749,P0.05)。2.Western blot结果显示,SAH组小鼠室周p ERK、AQP1和AQP4蛋白较未注射组小鼠均显著增加(P0.05),SAH小鼠术后8h、16h和24h连续脑池注射ERK抑制剂U0126后,室周AQP1和AQP4蛋白表达显著降低(P0.05)。3.与Sham组相比,SAH组小鼠神经功能显著下降(P0.05)、血脑屏障通透性和脑组织含水量均显著增加(P0.05),SAH小鼠术后8h、16h和24h连续脑池注射ERK抑制剂U0126后,神经功能显著上升(P0.05)、血脑屏障通透性和脑组织含水量均显著降低(P0.05)。结论1.枕大池二次注血法建立SAH模型小鼠,SAH急性期(术后8h、16h、24h和3d)均出现脑损伤,且在术后24h损伤最严重;SAH慢性期(术后1周、2周和4周)脑积水组小鼠较无脑积水组脑损伤严重,脑积水小鼠在SAH术后4周损伤最严重。2.SAH急性期小鼠在术后24h时皮质和室周AQP4表达水平最高,脉络丛和室周AQP1表达水平在术后24h时分别最低和最高;SAH慢性期脑积水小鼠较无脑积水小鼠室周和皮质AQP4表达从术后2周开始上调,脉络丛和室周AQP1表达从术后4周开始上调;SAH小鼠AQP4和AQP1表达随着脑积水严重程度的增加而增加。3.SAH急性期小鼠室周p ERK蛋白表达分别与AQP1和AQP4蛋白表达呈显著正相关。ERK抑制剂U0126可显著下调SAH小鼠室周AQP1和AQP4蛋白的表达。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R743.35
【部分图文】：

蛛网膜下腔出血（SAH）急性期不同时间点小鼠神经行为学评分

2 蛛网膜下腔出血（SAH）急性期不同时间点小鼠脑组织含水量照组；Sham：假手术组；SAH 组分为 4 组，分别为术后 8h、16h每组各 8 只小鼠。* 与 sham 组相比，P<0.05，差异有统计学意义 蛛网膜下腔出血（SAH）急性期不同时间点小鼠血脑屏障通透性术组；SAH 组分为 4 组，分别为术后 8h、16h、24h、3d。每组各与 sham 组相比，P<0.05，差异有统计学意义。

网膜下腔出血（SAH）急性期不同时间点小鼠脑组织含；Sham：假手术组；SAH 组分为 4 组，分别为术后 8h 8 只小鼠。* 与 sham 组相比，P<0.05，差异有统计学
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;Aquaporins as potential drug targets[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年04期

本文编号：2862546