磁性双氢青蒿素纳米脂质体靶向抑制人头颈鳞癌细胞增殖的研究

发布时间：2020-11-03 13:08

　　头颈部鳞状细胞癌占全身恶性肿瘤发病率的第六位,2015年我国头颈部恶性肿瘤癌发病约225,000例,死亡77,500例,其中以头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)最为常见,常发生于鼻腔、鼻窦、口腔、咽部和喉部等部位的黏膜上皮,具有发病隐匿、侵袭性强、容易复发和转移、预后差、有较高的致死率和致残率等特点,手术治疗为主辅以放、化疗的联合治疗方法虽然有效地改善了患者的生活质量,但不能显著地提高患者术后5年生存率。因此,研究者的关注点正在逐渐转向靶向精确治疗,弥补传统治疗策略的不足,达到提高患者生存率目的。近年来,随着纳米医学的不断发展,学者们相继报道了许多应用纳米载体制剂提高HNSCC诊断治疗效率的研究,如:口腔癌周局部注射高载药量淋巴结靶向平阳霉素活性炭纳米微粒,相较平阳霉素取得更好治疗效果;用载反义表皮生长因子受体(EGFR)寡核苷酸纳米颗粒转染小鼠人头颈鳞癌SCC VII细胞,阻断EGFR表达并联合4Gy放射治疗,具有放疗增敏效应;纤维连接蛋白模拟肽(FMP)与羧基化氧化铁纳米粒子(IO)共轭结合并搭载光动力疗法(PDT)药物PC 4,靶向肿瘤整合素β1配体,对人头颈鳞癌鼠移植瘤给药后药物靶向肿瘤富集,较游离PC 4具有更高的抑瘤作用并且可明显减少PC 4用药剂量,有效降低机体药物毒性。纳米载体药物的优点包括:1、纳米药物经化学或物理修饰,如:肿瘤特异性抗体,肽,小分子和寡核苷酸,可实现靶向给药;2、纳米载体可提高药物的生物相容性,制备不溶或难溶于水药物的注射剂型,提高靶细胞对药物的摄取率;3、减小用药剂量,有效降低药物毒副作用;4、保护药物活性:在循环过程中可起到与机体组织隔绝的作用,避免体内某些活性成分对药物活性的降解和破坏。大量的体外或动物实验证实DHA对多种肿瘤具有杀伤作用,其中DHA具有明确的杀伤HNSCC作用。但要开发DHA为抗肿瘤药物,将受到DHA自身物化特性的限制,如:DHA不溶于水、难溶于脂质,普通固态制剂不能达到有效抑瘤血药浓度;血浆t1/2仅有34~90min等,促使当今国内、外对dha的研究不断深入,期待通过改变剂型实现延长dha有效血药浓度时间、提高dha生物相容性的目的。dha与纳米载体结合,就是一种有效的改善手段。基于上述观点,本研究设计磁性纳米粒与脂质体结合搭载dha(dha-mag-nl)纳米粒,提高dha的生物相容性、保护dha活性,达到提高dha血药浓度、延长dhat1/2的目的,为开发dha作为临床抗肿瘤药物提供条件和实验基础。实验大体分为三部分:第一部分磁性双氢青蒿素纳米脂质体的制备及表征特性鉴定目的:优化纳米磁性载药脂质体的合成条件,构建dha-mag-nl并检测相应关键表征,以达到静脉用药要求。方法:1采用改良化学沉淀法合成fe304,观察其磁响应性和磁稳定性。2通过路易斯酸催化反应合成peg-dha,定量后建立浓度标准曲线方程。3采用逆向蒸发法合成dha-mag-nl磁靶向纳米脂质体,通过检测其包封率优化合成配方。4检测优化配方合成的dha-mag-nl磁靶向纳米脂质体相应关键表征参数,作为载药系统评价指标。结果:1磁性fe3o4纳米粒子具有很好的磁响应性和超顺磁性。2建立peg-dha溶液标准浓度曲线回归方程,y=55.48x-1.571,r2=0.999,线性良好。3l9(34)正交实验得到最佳配方为pc:ch(w/w)4:1,pc:dha(w/w)20:1,pc:mag(w/w)10:1,dha:peg(m/m)1:10,可制得具有较高包封率的dha-mag-nl磁性脂质体纳米粒;影响磁性脂质体包封率的各影响因素的重要性依次递减为:pc:ch(因素a)dha:peg(因素d)pc:mag(因素c)pc:dha(因素b)。4dha-mag-nl纳米脂质体最佳配方的peg-dha包封率为82.12±0.91%;载药量为5.87±0.06%;peg-dha含药量为2.46±0.03mg;粒径在209.10±4.92nm范围,pdi=0.25±0.02,粒径均匀;粒子所带电荷数为-37.13±1.01mv。5dha-mag-nl纳米粒在4℃条件下保存3个月,其粒径与包封率两项关键物理参数经统计学分析与初始合成完毕时没有明显差异(p0.01);dha-mag-nl纳米粒在-20℃和室温(25℃)条件下保存3个月,其粒径与包封率两项关键物理参数经统计学分析与初始合成完毕时有明显差异(p0.01)。结论:成功合成dha-mag-nl磁靶向纳米脂质体dha载药系统。第二部分磁性双氢青蒿素纳米脂质体体外靶向作用的研究目的:观察磁场作用下dha-mag-nl的靶向分布情况,初步验证dha-mag-nl的靶向作用。方法:1hep-2和cal-27细胞给予dii标记dha-mag-nl,在磁场和无磁场作用下共孵育取1h,dapi复染,荧光显微镜观察dha-mag-nl磁靶向作用。2kmmice小鼠麻醉后,尾静脉注射等剂量dii荧光标记的dha-mag-nl悬液,左肾暴露于4500高斯磁场中1h,对比左、右侧肾脏铁染色组织切片;对比左、右侧肾组织冰冻切片荧光染色图像。结果:1在磁场作用下hep-2、cal-27细胞给予dii荧光标记的dha-mag-nl悬液共孵育1h,dii荧光强度和细胞结合磁粒(fe3o4)数量均明显高于无磁场作用下的hep-2、cal-27细胞。2尾静脉注射dii荧光标记的dha-mag-nl悬液,小鼠左肾在磁场作用下与无磁场作用的右肾组织相比荧光强度有显著差异;常规组织切片铁染色观察,左肾在磁场作用下与无磁场作用的右肾组织相比,左肾局灶可见明显蓝色颗粒;右肾未见明确蓝色颗粒,两者差别显著。3体内外靶向实验结果提示dha-mag-nl纳米颗粒在体内外都具有较强的磁靶向性。结论:初步验证磁性双氢青蒿素纳米脂质体具有体内外靶向作用。第三部分磁性双氢青蒿素纳米脂质体对人舌鳞癌cal-27细胞系及喉癌hep-2细胞系的体外增殖抑制作用的研究目的:观察dha-mag-nl磁性纳米脂质体对cal-27及hep-2细胞系的体外抑制作用。方法:1mtt法检测不同干预时间时,dha-mag-nl浓度梯度对hep-2和cal-27细胞增殖的影响。2设立实验分组:对照组、dha组、dha-mag-nl组和磁场作用dha-mag-nl组,流式细胞技术检测dha浓度40μm在不同干预时间对hep-2和cal-27细胞周期的影响。3设立实验分组:对照组、dha组、dha-mag-nl组和磁场作用dha-mag-nl组,流式细胞技术检测dha浓度40μm在不同干预时间对hep-2和cal-27细胞凋亡的影响。结果:1mtt法检测dha-mag-nl对hep-2和cal-27肿瘤细胞作用24h和48h,可抑制肿瘤细胞增殖,且与药物剂量及干预时间呈依赖关系。ic50值分别为28.66μm和15.67μm,41.75μm和11.86μm。相对于hep-2细胞,dha-mag-nl对cal-27细胞干预24h的增殖抑制作用稍弱。2以dha浓度为准(60μm),药物作用24h后,流式细胞技术检测细胞周期,两种hnscc细胞在dha和磁场中dha-mag-nl靶向干预下与对照组相比,具有明确的细胞周期g0/g1期阻滞作用(p0.01);hep-2细胞在dha-mag-nl干预下与对照组相比,具有细胞周期g0/g1期阻滞作用(p0.01);cal-27细胞在dha-mag-nl干预下与对照组相比,细胞周期分布比例无统计学差异(p0.05)。检测结果表明:dha-mag-nl对cal-27细胞抑制作用相应较弱。3以dha浓度为准(60μm),药物作用24h后,流式细胞技术检测细胞凋亡,两种hnscc细胞在dha、dha-mag-nl和磁场中dha-mag-nl靶向干预下与对照组相比,早期和晚期凋亡细胞比例显著增加(p0.01);dha-mag-nl在非靶向作用下对细胞凋亡影响明显弱于dha和磁场中dha-mag-nl靶向干预作用(p0.01);统计学分析显示,dha-mag-nl靶向作用24h对cal-27肿瘤细胞的促凋亡作用弱于dha的促凋亡作用(p0.01)。结论:dha-mag-nl可抑制hep-2和cal-27肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡,且与药物剂量及干预时间呈依赖关系。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R739.91
【部分图文】：

曲线,磁响应性,纳米粒子,磁场

04混悬液透明玻瓶一侧如图1-1，见混悬液快速向磁铁一侧聚集(颜色加深)；说明Fe3O4有很好的磁响应性。2 PEG-DHA产量按照2.3方法制备的PEG-DHA，经2.5方法提纯蒸去有机溶剂后，得到约241.70±10.97mg PEG-DHA，用氯仿定溶至10ml，4℃冰箱保存备用。3 建立DHA溶液标准浓度曲线按照2.7.3方法配制DHA标准溶液系列浓度，HPLC检测色谱图像显示DHA呈现α、β异构体双峰色谱图像（图1-2），保留时间分别为7.056min和10.398min

HPLC色谱,磁响应性,图像,纳米粒子