罗哌卡因对乳腺癌预后相关因素的影响及机制研究

发布时间：2020-11-05 00:05

　　 肿瘤发生、发展的过程非常复杂,机体中部分组织细胞受到致癌因素的影响,在基因水平失去正常调控生长的能力,发生异常増生致癌变。目前,外科手术仍然是治疗恶性肿瘤的最常用的方法。原发肿瘤切除后,局部肿瘤复发及远处转移治疗效果差。转移、复发是恶性肿瘤患者死亡的最主要原因。术中无法完全避免癌细胞的播散、入血,麻醉及手术影响新陈代谢、神经分泌因子,引起感染及免疫应激,进而影响着恶性肿瘤术后的转归。乳腺癌,目前当之无愧为女性最常患的恶性肿瘤之一,在女性患者中发病率已跃居第一,死亡率也仅仅低于位居第一的肺癌。随着近些年来人们生活方式变化以及生存与生态环境的不断恶化,每年新增乳腺癌病例高达3-4%的,且越来越呈现年轻化的趋势。近年来,随着围手术期医学得到越来越多的重视,麻醉药物及方式与恶性肿瘤术中及术后的关系及影响逐渐成为新的热点及关注对象。研究显示,不同麻醉方案的实施可影响恶性肿瘤微环境,从而影响其发展。最新的研究提示,麻醉药物亦可直接作用于恶性肿瘤病灶,研究涉及到氟烷、硫喷妥钠、丙泊酚等少数麻醉药物,而其他的全麻药物及局麻药物对恶性肿瘤转归的影响研究较少。因为是较新的研究领域,各家尚存在争论。自古以来,科学总是在破与立中向前发展的,恶性肿瘤目前依然是医学界乃至生命科学的难题,希望麻醉对于恶性肿瘤的影响的研究可以为恶性肿瘤的防治添砖加瓦。本实验选用的局麻药罗哌卡因(ropivacaine,RP),(S)-N-(2,6-二甲基苯基)-1-丙基-2哌啶羧酰胺,为纯左旋(S)-对映异构体,是临床工作中在椎管内麻醉及周围神经阻滞中最常选取的局麻药。现有的研究显示,局麻药对于恶性肿瘤病人的预后有积极的影响,而国内对罗哌卡因在抗肿瘤方面的研究还很少,局麻药尚存在诸多未被发现的有益之处,等待我们对其进行更深入的研究。目的本研究首先观察罗哌卡因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡、侵袭及迁徙的影响,进而又建立了人乳腺癌MCF-7细胞移植瘤模型,观察罗哌卡因作用下乳腺癌移植瘤的生长、形态学变化以及在分子水平影响,最后观察了临床手术麻醉中使用罗哌卡因后对乳腺癌患者预后的影响,为临床手术麻醉中选择对乳腺癌患者更适合的麻醉方式及药物提供新的科学依据。本研究共分以下三个部分。第一部分罗哌卡因对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁徙的影响方法1.MTT法检测不同浓度的罗哌卡因(100μg/ml、200μg/ml及400μg/ml)孵育人乳腺癌MCF-7细胞12h后,对乳腺癌细胞增殖能力的影响,对照组用等量的生理盐水。2.流式细胞技术检测不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,对乳腺癌细胞周期的影响。3.微管示踪法观察不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后对乳腺癌细胞有丝分裂的影响。4.Hoechst 33258单染及Hoechst 33258/PI双染法检测不同浓度的罗哌卡因(同上)对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡与死亡的影响。5.Transwell小室法测定不同浓度的罗哌卡因(同上)对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的影响。6.Western blotting法检测不同浓度的罗哌卡因(同上)对人乳腺癌MCF-7细胞MMP-2蛋白与MMP-9蛋白的表达的影响,进而研究对其侵袭能力的影响。7.细胞划痕法检测不同浓度的罗哌卡因(同上)处理后对人乳腺癌MCF-7细胞的迁移的影响。8.微丝与线粒体示踪法观察不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后对乳腺癌细胞微丝变化及线粒体数量的影响。结果1.MTT法检测结果显示,不同浓度的罗哌卡因(100μg/ml、200μg/ml及400μg/ml)对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖有显著的抑制作用(P0.05)。2.流式细胞技术检测结果显示,不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,乳腺癌细胞处于分裂期或为分裂期做准备的时期减少,而处于静止期的细胞明显增多,并与罗哌卡因的浓度有关(P0.05)。3.微管示踪法显示,不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,细胞有丝分裂相减少,并与罗哌卡因的浓度有关,浓度越高有丝分裂相的减少越明显(P0.05)。4.Hoechst 33258单染及Hoechst 33258/PI双染法检测结果显示,不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,细胞的凋亡率升高,细胞的死亡率也升高,并随罗哌卡因浓度升高而升高(P0.05)。5.Transwell小室法检测显示,不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,乳腺癌细胞穿过小室底部微孔滤膜背面每视野的细胞数明显降低,减少程度与罗哌卡因浓度有关(P0.05)。6.Western blotting法检测结果显示,不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,细胞MMP-2蛋白及MMP-9蛋白表达量随罗哌卡因的浓度升高而降低(P0.05)。7.细胞划痕法检测显示,不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,相对愈合距离随罗哌卡因浓度的升高而逐渐降低(P0.05)。8.微丝与线粒体示踪法观察显示,不同浓度的罗哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,随着罗哌卡因浓度的提高,微丝与线粒体的形态学改变朝着不利于肿瘤细胞运动的方向发展。第二部分罗哌卡因对乳腺癌移植瘤的影响方法1.以30只BALB/c-nu裸鼠建立人MCF-7乳腺癌移植瘤模型,最终选取24只肿瘤最小径在2 mmb10 mm范围内的裸鼠纳入研究,随机分为2组即对照组C’组、罗哌卡因处理组R’组,C’组在肿瘤周围注射生理盐水,1ml/次,R’组在肿瘤周围注射2mg/ml罗哌卡因1ml/次,1次/d,连续15d。以后每隔三天测量肿瘤大小,给药终止一天后结束测量,计算各组肿瘤体积,并取得平均值。给药终止一天后处死各组裸鼠,选用颈椎脱位法。颈椎脱位法处死裸鼠后可完整的剖出人乳腺癌MCF-7细胞移植瘤组织,并量出最终肿瘤大小,后将其进行固定、包埋,也可放置于-80℃冰箱中保存待用。2.对移植瘤的体积进行测量,绘制生长曲线,观察罗哌卡因对移植瘤生长的影响。3.苏木素-伊红(H.E)染色法,观察罗哌卡因对乳腺癌移植瘤形态学的影响。4.免疫组织化学染色法,观察罗哌卡因对乳腺癌移植瘤上皮-间质转化标志蛋白及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。5.免疫荧光法,观察罗哌卡因对乳腺癌移植瘤上皮-间质转化标志蛋白表达的影响。6.Western blot检测罗哌卡因对乳腺癌移植瘤TGF-β、VEGF、MMP-9表达的影响。结果1.测量移植瘤体积,绘制生长曲线显示,R’组较C’组乳腺癌移植瘤生长明显缓慢(P0.05)。2.苏木素-伊红(H.E)染色法,观察发现R’病理学改变向恶性程度减低方向发展。3.免疫组织化学染色法观察显示,R’组E-钙粘素呈强表达,波形蛋白表达较弱,HIF-1α表达较弱。4.免疫荧光法观察显示,R’组E-钙粘素表达较强,波形蛋白表达较弱。5.Western blot检测显示,与C’组相比,R’组乳腺癌移植瘤TGF-β、VEGF、MMP-9的表达显著减弱(p0.05)。第三部分罗哌卡因局部浸润麻醉联合胸肌神经阻滞及切口持续浸润镇痛对乳腺癌患者预后的影响方法1.68例接受乳腺癌根治术的患者,随机分为两组,常规组(G组)和实验组(E组),各包括34例患者。G组采用喉罩全凭静脉麻醉及自控静脉镇痛(PCIA),E组采用罗哌卡因局部浸润麻醉联合胸肌神经阻滞复合喉罩全凭静脉麻醉及切口持续浸润镇痛。在手术前(T_0)、手术开始时(T_1)、手术1.5h时(T_2)、手术结束时(T_3)及术后3天(T_4)4个时间点,抽取每位患者6ml静脉血,获取全血与血浆分别置于EDTA管中,后保存于-80℃冰箱。2.两组患者均在T_0、T_1、T_2、T_3及T_4时间点应用高效液相层析法测定PRL、GH、IL-8、皮质醇(Cor)的水平,获知机体应激反应变化。3.两组患者均在T_0、T_1、T_2、T_3及T_4时间点采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚型(CD_3~+、CD_4~+和CD_8~+)及NK细胞,比较CD_3~+T淋巴细胞百分比和CD_4~+/CD_8~+比值,揭示患者免疫功能变化。4.两组患者均采用ELISA法检测T_0、T_1、T_2、T_3及T_4时间点VEGF-C和TGF-β的变化。5.术后记录两组患者肿瘤大小,是否接受化疗、放疗及内分泌治疗,计算诺丁汉预后指数(NPI)。两组患者均随访36个月,并记录复发转移及接受治疗情况。结果1.肿瘤大小、分级及预后因素两组比较差异没有统计学意义(p0.05)。两组均在诺丁汉预后指数评分中间范围内。此外,初始手术治疗后化疗,放射治疗和内分泌治疗的发生率在两组之间没有显著差异(p0.05)2.两组PRL T_0最低,T_1最高、T_2-T_4逐渐降低,E组明显低于G组(p0.05);GH在T_1-T_2逐渐升高,T_3-T_4逐渐降低,且E组明显低于G组(p0.05);IL-8在T_1-T_4逐渐降低,且E组明显低于G组(p0.05);Cor在T_1-T_2逐渐升高,T_3-T_4逐渐降低,且E组明显低于G组(p0.05)。3.T_0时G组和E组的静脉血中的CD_3~+T淋巴细胞百分比无显著性差别。T_1时G组的CD_3~+T淋巴细胞百分比明显低于E组(p0.05)。T_2、T_3时间点G组的CD_3~+T淋巴细胞百分比低于E组(p0.05)。T_4时间点时G组和E组的CD_3~+T淋巴细胞百分比均有不同程度的上升,但仍低于术前水平。E组CD_3~+T淋巴细胞百分比仍高于G组(p0.05)。两组CD_4~+/CD_8~+比值在术前无明显差异,在T_1时两组CD_4~+/CD_8~+比值均显著降低(p0.05),且G组下降程度更甚于E组(p0.05)。T_2、T_3时间点CD_4~+/CD_8~+比值明显下降,但E组比值仍高于G组(p0.05)。T_4时间点CD_4~+/CD_8~+比值明显下降,但E组比值仍高于G组(p0.05)。同时,各组CD_4~+/CD_8~+比值在T_4时间点有不同程度的上升,但仍低于术前水平。此外,E组CD_4~+/CD_8~+比值仍高于G组(p0.05)。NK细胞在T_0-T_4无显著变化,组间比较T_3-T_4时E组明显高于G组(p0.05)。4.两组患者VEGF-C、TGF-β比较差异无统计学意义(p0.05)。5.随访结果显示E组共2位患者(6%)复发,24个月与36个月无复发生存率均为94%;G组共复发8位患者(24%),24个月无复发生存率82%,36个月无复发生存率76%。两组比较,差异有统计学意义(p0.05)。使用Kaplan-Meier进行分析,E组的复发时间较慢(p0.05)。结论1、罗哌卡因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭及迁徙有抑制作用,对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡有促进作用。2、罗哌卡因对人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长有抑制作用,并可抑制上皮-间质转化的发生,降低HIF-1α、TGF-β、VEGF及MMP-9的表达。3、罗哌卡因局部浸润麻醉联合胸肌神经阻滞及切口持续浸润镇痛能够减少应激反应、改善免疫抑制、在36个月的随访期间将复发或转移的风险降低了四倍。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R614;R737.9
【部分图文】：

图 1-1 不同浓度的罗哌卡因对人乳腺癌 MCF-7 细胞增活力的影响（*P<0.0**P<0.01 与对照组比较）.2 不同浓度的罗哌卡因对人乳腺癌 MCF-7 细胞细胞周期的影响人乳腺癌MCF-7细胞作为恶性肿瘤细胞其增殖是比较旺盛的。对照组

罗哌卡因对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁徙的影响16图1-2 不同浓度的罗哌卡因对人乳腺癌MCF-7细胞细胞周期的影响（*P<0.05，**P<0.01与对照组比较）2.1.3 不同浓度的罗哌卡因对人乳腺癌 MCF-7 细胞有丝分裂的影响人乳腺癌 MCF-7 细胞分别于对照组（C 组）、罗哌卡因 100μg/ml(R1 组)、罗哌卡因 200μg/ml 组(R2 组)、罗哌卡因 400μg/ml 组(R3 组)以不同浓度罗哌卡因处理后，加入微管示踪剂，染色，并以 DAPI 复染，在显微镜下观察细胞变化，结果显示：随着罗哌卡因浓度的不断升高，R1、R2、R3 组细胞的有丝分裂相较对照组逐渐减少差异明显，MCF-7 细胞有丝分裂相的减少与罗哌卡因的浓度有关，浓度越高有丝分裂相的减少越明显（见图 1-3）。图 1-3 不同浓度的罗哌卡因对人乳腺癌 MCF-7 细胞有丝分裂的影响

同浓度的罗哌卡因对人乳腺癌MCF-7细胞细胞周期的影响（*P<与对照组比较）浓度的罗哌卡因对人乳腺癌 MCF-7 细胞有丝分裂的影响癌 MCF-7 细胞分别于对照组（C 组）、罗哌卡因 100μg/00μg/ml 组(R2 组)、罗哌卡因 400μg/ml 组(R3 组)以不同浓入微管示踪剂，染色，并以 DAPI 复染，在显微镜下观随着罗哌卡因浓度的不断升高，R1、R2、R3 组细胞的有减少差异明显，MCF-7 细胞有丝分裂相的减少与罗哌卡高有丝分裂相的减少越明显（见图 1-3）。
【参考文献】

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本文编号：2870809