复方新斯的明山莨菪碱对缺血性脑卒中的治疗作用研究

发布时间：2017-04-18 13:02

  本文关键词：复方新斯的明山莨菪碱对缺血性脑卒中的治疗作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的：脑卒中又称脑中风,具有高致残率、高致死率、高复发率等特点,是人类致死率排名第二高的疾病,严重威胁着人类健康和生命。在我国,随着人口老龄化的发展及人们生活方式的改变,脑卒中发病率有逐年增多的趋势,脑卒中预后极差,给病人、家庭和社会造成严重精神和经济负担。脑卒中主要分为缺血性卒中和出血性卒中,多数脑卒中病人为缺血性脑卒中。目前对缺血性脑卒中的治疗方法主要是：溶栓和抗血小板聚集,治疗时间窗窄且有出血风险,所以对脑卒中的预防和治疗是摆在人类面前很棘手的课题,研发出安全有效的抗脑卒中药物尤为迫切。我们课题组前期研究表明：胆碱酯酶抑制剂甲硫酸新斯的明,可以增加内源性乙酰胆碱含量,进而发挥脑保护作用,新斯的明发挥脑保护作用是通过乙酰胆碱烟碱型受体(nAChR)而非乙酰胆碱毒蕈碱型受体(mAChR),然而单用新斯的明治疗脑卒中会发生很多副反应,包括：心动过缓、腹痛、流涎、支气管痉挛等。作为非选择性M受体阻断剂的山莨菪碱,研究表明其具有抗炎抗感染性休克的作用。分别结合新斯的明和山莨菪碱单药的作用,我们考虑将其组成复方用于治疗缺血性脑卒中,找出最佳复方配比并对其作用机制进行探讨。实验设计和方法：实验一：新斯的明和山莨若碱联合给药,筛选出治疗缺血性脑卒中最佳复方比例。雄性SD大鼠(240-270 g)70只,2%异氟烷气体麻醉,大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)制作急性缺血性脑卒中模型,术后立即舌下静脉给予药物,新斯的明10、20、40μg/kg,山莨菪碱10、20、40 mg/kg,对照组给予生理盐水,激光多普勒检测手术前后脑血流(CBF)的变化情况。24 h后神经学评分,然后脱臼处死动物,取脑切片进行1% TTC染色,数码相机拍照统计脑梗死面积。根据单药结果用山莨菪碱20 mg/kg与新斯的明10、20、40、80 gg/kg组成复方,找出最佳复方比例。实验二：根据最佳复方比例观察该复方的量效关系,确定最佳复方配伍,然后根据最佳复方配伍完成时效关系实验,确定最佳治疗时间窗。根据复方新斯的明山莨菪碱最佳复方比例(1：500),设定三个复方配比剂量,分别为：新斯的明+山莨菪碱10μg/kg+5 mg/kg,20μg/kg+10 mg/kg,40μg/kg+20 mg/kg,筛选出最佳配比,根据该配比分别做了MCAO后1、1.5和2h后给药的时效实验。实验三：观察该复方药物与α7nAChR的作用关系。体外实验选用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,给药组给予复方药物(新斯的明0.2μg/ml+山莨菪碱100μg/ml)或者750μM的ACh进行处理,对照组给予生理盐水,20 min后用含荧光标记的a-Bgt着色,多聚甲醛固定后用激光共聚焦显微镜检测细胞荧光强度。实验四：进一步验证该复方药物通过a7nAChR发挥治疗急性缺血性脑卒中的作用。用a7nAChR基因敲除和同窝野生型小鼠进行实验,观察药物对a7nAChR敲除小鼠和野生型小鼠MCAO后脑梗死面积及神经学评分的影响。实验五：观察该复方通过a7nAChR发挥脑保护作用的下游机制。根据a7nAChR敲除与否和给药与否将实验分成四组,n=6。ELISA测定动物血清炎性细胞因子如：(TNF-α, IL-1α和IL-6)等的含量,对比野生型和基因敲除动物给药与否对炎性因子含量差异的影响。采用Western Blot检测该复方药物对野生型小鼠MCAO后梗死半暗带细胞凋亡因子(caspase-8, cleaved caspase-8, caspase-12, Bad, Bax, Bcl-2, Bcl-xl)等的影响,找出有差异的凋亡因子,用a7nAChR基因敲除小鼠进一步验证细胞凋亡通路作用机制。实验结果：一、新斯的明和山莨菪碱分别单独给药都可以明显减少脑梗死面积,新斯的明20和40 μg/kg剂量下脑梗死面积明显变小,山莨菪碱20和40 mg/kg剂量下脑梗死面积明显变小。新斯的明40 μg/kg+山莨菪碱20 mg/kg的复方组合脑梗死面积最小,脑保护作用最强。确定该复方的最佳比例为：1：500。二、新斯的明和山莨菪碱最佳复方比例为：1：500,该复方比例呈一定的量效关系。复方新斯的明山莨菪碱最佳配伍为：新斯的明40μg/kg+山莨菪碱20 mg/kg o时效实验证明该复方的最佳治疗时间窗为梗死后2h内。三、激光共聚焦显微镜观察结果证明：该复方药物能够减弱a-Bgt与RAW264.7细胞表面的a7nAChR结合,且该复方可以促进ACh与a7nAChR的结合。四、与野生型动物相比,a7nAChR基因敲除动物MCAO后脑梗死比例显著增加,且给予复方药物后梗死面积未明显减小,神经学评分亦未见改善。五、野生型小鼠给予复方药物后死亡通路凋亡因子(caspase-8, cleaved caspase-8)未变化,内质网通路凋亡因子(caspase-12)也没有变化,线粒体凋亡通路促凋亡因子(Bad, Bax)表达量降低,抗凋亡因子(Bcl-2, Bcl-xl)表达量有所增加。但是在a7nAChR基因敲除小鼠上,药物不能改变线粒体凋亡通路凋亡因子(Bad, Bax, Bcl-2, Bcl-xl)含量。结论：1.复方新斯的明山莨菪碱对大鼠急性缺血性脑卒中具有治疗作用,且最佳复方配伍为：新斯的明+山莨菪碱(40μg/kg+20mg/kg),最佳治疗时间在2h内。2.该复方药物通过α7nAChR发挥对缺血性脑卒中的治疗作用。3.该复方通过α7nAChR下游抗炎通路和线粒体抗凋亡通路发挥脑保护作用。
【关键词】：新斯的明 山莨菪碱 复方 MCAO α7nAChR 缺血性脑卒中
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 英文缩写词11-12
• 前言12-13
• 实验材料和实验方法13-32
• 一、实验材料13-19
• 二、实验方法19-32
• 实验流程32-34
• 实验结果34-43
• 一、筛选新斯的明与山莨菪碱治疗缺血性脑卒中最佳复方比例34-36
• 二、确定复方新斯的明山莨菪碱最佳配伍剂量36-37
• 三、观察复方药物对缺血性脑卒中的最佳治疗时间窗37-38
• 四、复方新斯的明山莨菪碱促进ACh与α7nAChR结合38-39
• 五、复方药物通过α7nAChR发挥治疗缺血性脑卒中作用39-40
• 六、复方药物通过α7nAChR发挥下游抗炎作用40-41
• 七、复方药物通过α7nAChR下游线粒体通路发挥抗凋亡作用41-43
• 讨论43-46
• 参考文献46-49
• 综述49-59
• 参考文献55-59
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明59-61
• 致谢61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 孔莉;孙中安;赵宏图;;酮色林敷料对糖尿病足创面愈合的效果及其护理[J];实用医药杂志;2011年07期

2 ;中国缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作二级预防指南2010[J];中国医学前沿杂志(电子版);2011年03期

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本文编号：314910