晚期氧化蛋白产物对兔膝骨关节炎关节软骨及滑膜影响的实验研究

发布时间：2017-04-29 18:02

  本文关键词：晚期氧化蛋白产物对兔膝骨关节炎关节软骨及滑膜影响的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种常见的慢性退行性关节疾病,典型的病理改变包括软骨的降解、滑膜的炎症、骨赘形成以及软骨下骨骨重塑等,因此它也是一种累及全关节的疾病。流行病学调查未发现其有明显的种族与地域性差异。在50岁以上的人群中,骨关节炎的致残比例约为2%～6%,这一比例在导致长期残疾的人类疾病中仅次于心血管疾病。由于其在中老年人中的发病率和致残率较高,骨关节炎被认为是影响人类健康最常见的疾病之一。据美国调查机构统计,因骨关节炎导致的医疗费用开支和其他经济损失年均高达1500亿美元,而其中一半以上消耗源于骨关节炎患者劳动能力的丧失。骨关节炎患者最主要的临床症状为关节疼痛,因而较其它关节疾病而言,骨关节炎更加容易限制患者的下肢运动能力,从而导致患者的长期劳动能力丧失,最终阻碍了社会与经济的发展。膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis, KOA)在骨关节炎中较常见,是一种慢性进行性骨关节病,多见于中老年人。据国外统计发现55～64岁的中老年人发病率高达40%。KOA病理改变主要为关节软骨基质崩解以及软骨细胞数量的减少。随着对膝骨关节炎的研究不断深入,越来越多的致病因素被发现,然而其病因及病理机制却仍不明确。各种因素导致的关节软骨损伤在生物学和形态学上高度一致,病变常常波及整个关节,包括关节软骨、软骨下骨、滑膜、关节滑液甚至韧带和周围的肌肉组织。膝骨关节炎发展的最终结果是关节正常结构的破坏以及关节功能的丧失,临床上患者常常因剧痛难忍而长期无法进行下肢活动。这些既影响了患者的生活质量也阻碍了社会的发展。因此,明确骨关节炎的发病机制对整个OA的防控工作具有越来越重要的意义。人体内氧化还原反应失衡导致活性氧类物质(Reactive Oxygen Species,ROS)积聚,最终引发氧化应激。机体在氧化应激状态下,大分子结构物质如蛋白质、脂质、DNA、RNA等因遭受氧化损伤而丧失正产的结构和功能,其中最易受到损伤的是蛋白质。而晚期氧化蛋白产物(Advanced Oxidation Protein Products, AOPPs)主要就是由体内血浆中白蛋白在氧化应激状态下经氧化修饰而生成的一种双酪氨酸蛋白交联物,AOPPs最早被发现是在慢性肾功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)的患者血浆中,最终证实其主要是由血清中的白蛋白被机体内产生的氧自由基和反应性氧氧化而生成。临床进一步研究发现,慢性肾衰竭患者以及进行过血液透析的患者体内均存在较常人更高浓度的AOPPs,且与上述疾病与相关的长期并发症存在直接关系。经实验证实,晚期氧化蛋白产物也能在体外进行合成,通过血浆或纯化的血清白蛋白经次氯酸氧化反应即可得到,且加入的次氯酸剂量与晚期氧化蛋白产物生成浓度呈正相关性。蛋白被氧化后会生成一种特有的双酪氨酸结构,人体血浆中晚期氧化蛋白产物浓度与双酪氨酸及蛋白质糖基化标志物戊糖苷浓度呈正比,因此可以认为晚期氧化蛋白产物是一种良好的氧化应激标志物,可特异性的评价蛋白质受氧化的程度。近十几年的研究发现,晚期氧化蛋白产物除了在尿毒症患者体内集聚外,它还与众多疾病相关。其中在对血液透析患者的实验研究发现此类患者血浆中的晚期氧化蛋白产物浓度与颈动脉内膜中层厚度呈明显的相关性。同时又有研究发现慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease, CKD)患者早期血浆中的晚期氧化蛋白产物浓度即显著升高,并随着肾功能恶化而进行性升高。Piwowar等发现2型糖尿病患者血浆晚期氧化蛋白产物浓度明显高于正常人,并与体内氧化及抗氧化标记物浓度呈相关性,研究还进一步发现有微血管病变的糖尿病患者,其血浆晚期氧化蛋白产物浓度也明显高于无病变患者。在对冠心病人群进行的一项研究中发现,冠心病患者血液中晚期氧化蛋白产物浓度明显高于正常人,并与冠心病的严重程度呈相关性,被认为是冠心病的一个独立危险因素。研究还发现冠心病病人血浆中晚期氧化蛋白产物与巯基比例明显升高,此研究认为晚期氧化蛋白产物与巯基比例升高可作为急性冠脉综合征发作的标志。过往文献报道有许多人类疾病都与晚期氧化蛋白产物的蓄积相关,如过敏性紫癜、IgA肾病、慢性炎症性肠病、肥胖、非酒精性脂肪肝、急性消化性溃疡等。临床上的研究促使学者们产生了对晚期氧化蛋白产物的兴趣,越来越多的动物实验被用来验证晚期氧化蛋白产物的作用。在一项大鼠在体实验研究中发现晚期氧化蛋白产物能刺激糖尿病大鼠肾脏组织内单核细胞趋化因子(Monocyte Chemotactic Protein-1)、转化生长因子(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等促炎细胞因子的合成与释放,最终导致肾单位结构破坏,尿蛋白排出量增加及血肌酐升高。另一项兔的在体实验证实晚期氧化蛋白产物能促进正常新西兰白兔大动脉壁产生细胞炎症和脂滴沉积,加速了高脂血症新西兰大白兔兔大动脉粥样斑块的形成。通过上述动物在体实验研究发现,在晚期氧化蛋白产物干预下,干预对应的组织中活性氧自由基均明显升高。Witko-Sarsat等通过体外实验研究进一步对晚期氧化蛋白产物的作用机制进行了探究,实验发现晚期氧化蛋白产物能通过激活单核细胞诱导呼吸链爆发,从而产生氧化应激。此后又有研究证实不论是慢性肾衰和糖尿病患者体内的晚期氧化蛋白产物,还是体外通过次氯酸氧化蛋白而产生的晚期氧化蛋白产物,它们均可通过细胞表面的晚期糖基化产物受体(Receptor of Advanced Glycation End Products, RAGE)介导的、ROS敏感的MAPK和NF-kB信号通路激活人血管内皮细胞。除上述作用机制以外,研究还发现晚期氧化蛋白产物能促使肾小球系膜细胞内形成超氧化物,最终导致转化生长因子(Transforming growth factor-β, TGF-β)的合成增加,并上调纤维蛋白和Ⅳ型胶原纤维基因及蛋白的表达,导致系膜细胞外基质沉积。晚期氧化蛋白产物还可介导肾脏足细胞损伤和凋亡,诱导心肌细胞死亡等。因此,晚期氧化蛋白产物不仅是氧化应激的后果,其本身也是活性氧自由基的来源,作为一种重要的大分子炎症介质具有广泛的病理作用,可能参与人类多种重要疾病的发生、发展。虽然骨关节炎的致病因素多种多样,但经过大量的研究后发现有两种因子与骨关节炎联系最为紧密,即基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)与白介素(Interleukin)。在骨关节炎相关的研究中发现无论是基质金属蛋白酶还是白介素,都参与关节软骨基质的代谢活动。软骨基质的降解更是与基质金属蛋白酶存在最直接的关系。MMPs是一种蛋白水解酶,但它的作用不仅仅局限在降解蛋白质,MMPs家族中的某些酶还能够特异性的降解细胞外基质(extra cenularmatrix,ECM)。如MMP-3,它属于基质分解素类的酶,广泛存在与各种组织中,主要作用是降解Ⅳ型胶原和蛋白聚糖以及与细胞内粘性相关的层粘连蛋白、纤维连接蛋白。还有MMP-13,它属于间质胶原酶类,能够特异性的降解胶原,包括软骨中广泛存在的Ⅱ型胶原就是其底物之一。本课题组前期研究证实了晚期氧化蛋白产物能通过NADPH氧化酶依赖的NF-κB通道诱导小鼠成纤维样滑膜细胞的炎症反应,使滑膜细胞中MMP-3与MMP-13表达上调。同时我们也证实了晚期氧化蛋白产物能通过刺激ROS的生成而抑制成骨样细胞的增值与分化。然而晚期氧化蛋白产物否在骨关节炎发生发展过程中对软骨和滑膜产生影响尚不清楚。因此我们假设晚期氧化蛋白产物在骨关节炎的病程中亦能对软骨和滑膜产生不利影响,其有能是骨关节炎发病的重要因素之一。为了证实上述假设,本研究采用新西兰大白兔行膝关节前交叉韧带离断与内侧半月板部分切除术建立骨关节炎模型后于关节腔内注射一定浓度晚期氧化蛋白产物,观察并分析关节软骨的大体形态,滑膜的相关蛋白表达,探讨氧化修饰蛋白质对关节软骨、滑膜组织的病理学作用及其与骨关节炎的关系。研究目的1.探讨外源性晚期氧化蛋白产物(AOPPs)对兔骨关节炎关节软骨组织大体形态的影响。2.探讨外源性晚期氧化蛋白产物(AOPPs)对滑膜组织中基质金属蛋白酶表达的影响。研究方法1.体外制备AOPPs修饰的兔血清白蛋白(AOPPs-RSA)。将兔血清白蛋白与次氯酸溶液以摩尔比例1：140混匀后,室温下反应30min,加入透析膜中并将透析膜在磷酸盐缓冲液中透析24小时去除游离次氯酸,将所得样品用滤器过滤去除内毒素,经鲎实验法测定内毒素含量低于0.25EU/ml。AOPPs-RSA中AOPPs含量的测定：以氯胺T为标准曲线,测定酸性条件下340nm吸光度值。最终将制备好的AOPPs稀释至0.20mg/ml后保存于-20℃冰箱备用。2.实验动物的药物干预及取材。购买5月龄雄性新西兰大白兔(南方医科大学动物实验中心)48只,体重2.0～2.5kg。饲养于适宜的环境中,给予充足的水与食物,严格昼夜周期。经10天适应环境后将48只雄性新西兰大白兔随机分假手术组(Sham-operated)、对照组(ACLT+MMx/PBS)和干预组(ACLT+MMx/AOPPs),每组16只。采用膝关节前交叉韧带离断与内侧半月板部分切除术(ACLT+MMx)建立骨关节炎模型。假手术组：采用与造模手术相同的手术入路打开关节腔,显露前交叉韧带后缝合切口。对照组与干预组均采用ACLT+MMx造成骨关节炎模型。给予2周时间愈合手术伤口后,干预组行lml AOPPs(200μg/ml)隔日关节腔内注射,对照组给予同等剂量磷酸盐缓冲液关节腔内隔日注射,假手术组不做任何处理。在关节腔注射开始4w、8w后随机取每组中的8只经麻醉后以耳缘静脉注射空气处死,分离双侧股骨及胫骨标本。关节标本的股骨与胫骨分离后剥除表面软组织,生理盐水纱布包埋后储存于-80℃冰箱备用。3.检测指标：(1)对膝关节标本行肉眼大体观察,取股骨髁作为组织标本,行India ink大体标本染色,并以India ink染色大体评分法对实验动物关节损伤进行评价。(2)股骨髁切片行番红O固绿染色。以Mankin评分为标准,对兔骨关节炎模型关节软骨的损伤进行评价。(3)取关节内滑膜组织为标本,提取滑膜组织中蛋白并通过蛋白印迹实验(Western-blot)检测滑膜组织中基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) MMP-3与MMP-13的表达量。研究结果1. AOPPs组4周和8周India ink染色大体观察评分分别为(4.19±0.60)、(5.75±0.60),假手术组分别为(1.06±0.18)、(1.38±0.60),磷酸盐缓冲液组分别为(2.50±0.46)、(3.06±0.62),磷酸盐缓冲液组的India ink大体评分在两个时间点上均较假手术组高,差异具有统计学意义(P0.05). AOPPs组的India ink染色大体评分在两个时间点均较另外两组高,且差异均具有统计学意义(P0.05)。2.组织学观察AOPPs组4周和8周Mankin评分分别为(8.19±0.70)、(11.94±0.90),假手术组分别为(0.75±0.53)、(1.06±0.73),磷酸盐缓冲液组分别为(4.25±1.46)、(4.50±0.89),磷酸盐缓冲液组的Mankin评分在两个时间点上均高于假手术组,差异具有统计学意义(P0.05). AOPPs组的Mankin评分在两个时间点上均高于另外两组,且差异均具有统计学意义(P0.05)。3. AOPPs组4周和8周滑膜组织中MMP-3、MMP-13相对表达量分别为(1.006±0.080)、(1.098±0.088),假手术组分别为(0.066±0.006)、(0.053±0.011),磷酸盐缓冲液组分别为(0.552±0.024)、(0.839±0.084)。磷酸盐缓冲液组滑膜组织中MMP-3、MMP-13的表达量在两个时间点均较假手术组高,且差异具有统计学意义(P0.05)。AOPPs组4周和8周滑膜组织中MMP-3、 MMP-13的表达量均较其它两组高,且差异均具有统计学差异(P0.05)。结论：外源性AOPPs刺激滑膜细胞MMP-3、MMP-13表达上调,加速软骨退变。
【关键词】：骨关节炎 晚期氧化蛋白产物 软骨 滑膜 基质金属蛋白酶
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R684.3
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-28
• 第一章 新西兰大白兔骨关节炎模型的建立及AOPPs的制备28-36
• 材料与方法28-34
• 结果34
• 讨论34-35
• 结论35-36
• 第二章 晚期氧化蛋白产物对OA软骨大体形态的影响36-48
• 材料与方法36-39
• 结果39-45
• 讨论45-47
• 结论47-48
• 第三章 晚期氧化蛋白产物对OA滑膜中MMP3、MMP13表达的影响48-56
• 材料与方法48-51
• 结果51-52
• 讨论52-55
• 结论55-56
• 全文结论56-57
• 参考文献57-66
• 攻读学位期间成果66-67
• 附录 中英文对照缩略词表67-68
• 致谢68-70

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 叶丹丽;刘庆;胡昕;;滑膜在骨关节炎发病中的作用研究进展[J];北方药学;2014年02期

2 Jie Shen;Shan Li;Di Chen;;TGF-，

本文编号：335323