新型含锶硫酸钙的生物相容性试验

发布时间：2017-05-25 10:26

  本文关键词：新型含锶硫酸钙的生物相容性试验，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在开放性骨折、良性或恶性骨肿瘤、胫骨平台压缩性骨折等骨科手术的处理过程中,骨科医师经常会遇到骨缺损这一难题。进行骨移植是解决这一问题的一项很常见的操作。自体骨移植是目前临床上解决骨缺损问题的金标准。自体骨移植的特点是具有良好的骨诱导性、成骨特性及骨传导性。但同时自体骨移植也有许多不可回避的局限性,例如骨缺损体积大时存在骨量不足的问题、伤口感染、伤口疼痛、血肿形成、感觉异常及遗留疤痕等。理想的骨移植替代材料应同时具有良好的骨诱导性、骨传导性、成骨特性及与自体骨相似的生物学特性。硫酸钙是目前临床上众多的骨移植替代材料中的一种。目前已广泛应用于四肢、椎体及骨肿瘤刮除术后骨缺损的填充,慢性骨髓炎病灶清除术后大段骨缺损,以及作为抗生素、抗肿瘤药物等的载体。它具有良好的生物相容性、可降解吸收、骨传导性等宝贵特性。但是,在促进骨再生方面,硫酸钙的作用主要是骨传导性即为成骨细胞的长入提供支架,而不具有骨诱导性或成骨特性。如何使硫酸钙在保留原有特性的同时又具有骨诱导性是近年来的研究热点。锶对骨的再生有益,它在促进成骨的同时又能抑制破骨,展现出了良好的骨诱导性。掺锶硫酸钙的制备早有报道,但是之前的研究为含锶化合物与硫酸钙的物理混合,无法保证产品在微观水平的绝对均一性。我们设想的实验目的在于探讨采用水热法制备一种新型的掺锶硫酸钙可达到完全均质性,并进行生物相容性检测,满足临床需要。依据GB/T 16886.1-2011,我们选择了迟发性超敏试验、细胞毒性试验、皮内刺激试验、急性全身毒性试验、亚急性全身毒性试验、肌肉内植入试验、红细胞微核试验共七项相关试验进行生物相容性评估。第一章新型含锶硫酸钙的制备目的：制备一种新型的掺锶硫酸钙。材料与方法：(1)共沉淀法制备含锶的二水硫酸钙将含有氢氧化钙和氢氧化锶的化合物按9：1的摩尔比进行混合,加入去离子水制成水溶液,然后将含混合液的烧杯放置于磁力搅拌器上,再将稀硫酸加入前述混合液中,滴入过程中保持30℃加热、持续搅拌,滴入完毕后维持加热及搅拌3小时。生成的沉淀经过滤、洗涤及干燥后,制成一定比例的含锶二水硫酸钙。方程式如下：Ca(OH)2+H2SO4=CaSO4↓+2H2O Sr(OH)2+H2SO4=SrSO4↓+2H2O(2)水热法制备含锶的α-半水硫酸钙将步骤1生成的产物按一定液固比与去离子水进行混合,利用水热反应釜在一定温度下反应6小时,后趁热将沉淀进行过滤、洗涤、干燥及球磨,即制得含锶α-半水硫酸钙。结果评价：制得粉末进行X线衍射、傅里叶变换红外光谱及差式量热扫描表征检测,证明所制备产物为含锶α-半水硫酸钙。结果：X线衍射结果示：于14.63°,25.72。和29.80°处可见α-半水硫酸钙的特征三强峰,而在24.78。处可见锶元素的特征峰；傅里叶变换红外光谱与α-半水硫酸钙标准图谱相似,说明制备过程中锶元素的加入并未影响α-半水硫酸钙特有的性质。差式量热扫描结果,制备材料中结构水含量为6.03%,与单纯α-半水硫酸钙的6.20%相类似。如图所示,于146.37℃处可见吸热峰,而放热峰位于174.64℃处,进一步证实了制备材料具备α-半水硫酸钙的性质。结论：成功制备了含锶硫酸钙。第二章 皮内刺激反应试验目的：评价被试材料是否有潜在急性毒性刺激反应。材料与方法：在每只兔脊柱一侧的5个点皮内注射0.2mL用极性溶剂制备的浸提液。同样在每只兔脊柱同一侧的后五个点皮内注射0.2mL极性溶剂对照液,在每只兔脊柱另一侧注射用非极性溶剂制备的浸提液和非极性溶剂对照液,操作步骤同上。结果：(1)极性浸提液组与极性溶剂对照组在24h、48h、72h三个时间点均未见红斑、水肿和溃疡反应,原发性刺激评分为0。(2)非极性浸提液组与非极性溶剂对照组在三个时间点可见有红斑,但浸提液组红斑范围并未超过溶剂对照组；同时两组均未见水肿。结论：可以认为该材料的皮内刺激反应为阴性。第三章 迟发型超敏反应试验目的：评价被试材料是否具有引发迟发型超敏反应的潜能。材料与方法：本试验采用最大剂量致敏试验,试验流程主要包括三个阶段：皮内诱导阶段、局部诱导阶段、激发阶段。结果：根据Magnusson和Kligman评级标准,实验组及对照组所用动物评级均为0级。结论：该材料不会引起迟发型超敏反应。第四章体外细胞毒性试验目的：将浸提液加入L-929细胞中以评估其对细胞形态学改变及毒性。材料和方法：试验使用L929系细胞株(标准推荐),配制1×105/mL的L929细胞悬液接种于96孔培养板,每孔接种100μL。置于培养箱(37℃,5%C02)培养24小时,待细胞大部分贴壁后,弃原培养基,用PBS液洗涤2次。实验组分别为100μL的100%、75%、50%、25%浸提液,阴性对照组为100μL相应的对照液,阳性对照组为100 u L的0.64%苯酚溶液,每组18个复孔。分别于培养24小时、48小时及72小时后取各组6孔进行MTT实验。在各观察期,弃去原培养液,然后加入MTT溶液20 μ L,37℃下继续孵育4小时后终止培养,吸去上清液,每孔加入150 u L二甲基亚砜(DMSO),振荡10min,用酶标仪在490nm波长下测定其光吸收值(A490),每孔测量3次,取其平均值作为其吸光值结果。结果：(1)各实验组不同时间的细胞增殖率：随着时间的增加,各实验组A490呈现增大的趋势,各实验组与阴性对照组A490值比较差异无统计学意义(P0.05)。(2)细胞毒性评价：实验组、阴性对照组不同时间点的毒性反应均为I级,无细胞毒性；而阳性对照组毒性反应均为Ⅳ级,有细胞毒性。结论：在本次试验条件下,被试材料的细胞毒性试验为无细胞毒性,符合国家标准。第五章急性全身毒性试验目的：评估该材料是否引起急性全身毒性。材料与方法：取SPF昆明小鼠12只,雌雄各半,随机分为实验组和对照组,实验组6只,对照组6只。腹部常规安尔碘消毒后,用一次性注射器分别向实验组小鼠腹腔内注50ml/kg体重剂量的浸提液一次,对照组小鼠注射50ml/kg体重剂量的生理盐水一次。结果：(1)在注射后当时实验组、对照组所有动物均未出现不适症状,实验组与对照组无明显差异。(2)所有小鼠体重都呈增加趋势。对体重增加量进行统计学分析(t检验),可见三个时间点的P值均大于0.05。结论：说明被试材料浸提液在短期内无潜在毒性,可以认为该材料的急性全身毒性实验符合实验要求。第六章 亚急性全身毒性试验目的：评估材料是否有潜在亚急性毒性反应。材料与方法：取SPF级昆明小鼠20只,雌雄各半,随机分为实验组和对照组,实验组10只,对照组10只。腹部常规安尔碘消毒后,用一次性注射器分别向实验组小鼠腹腔内注50ml/kg体重剂量的浸提液一次,对照组小鼠注射50ml/kg体重剂量的生理盐水一次。重复相同操作,连续注射14天。结果：(1)体重变化结果：浸提液注射后,所有小鼠体重呈增加趋势,与对照组小鼠体重的增长相比,无统计学差异。(2)临床观察方面,实验组及对照组均未出现异常情况,无红斑、水肿出现。(3)临床病理学检查结果：测定红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、血小板数(PLT)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)和平均红细胞体积(MCV)。实验组与对照组雌、雄分别对比,所测六项指标均无统计学差异。测定天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、血糖(GLU)、肌酐(CRE)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)等血清生化学指标。实验组与对照组雌、雄分别相比,所测定的八项生化指标均无统计学差异。(4)实验组和对照组在器官体重上无明显差异。心、肝、脾、肺、肾的病理切片上未观察到炎症或组织坏死现象。结论：五个方面的评价结果表明被试材料浸提液在长期反复接触时不会引起全身毒性。第七章哺乳动物红细胞微核实验目的：测试被试材料的潜在致突变性。材料与方法：对实验组及阴性对照组所有动物分别按20ml/kg腹腔注射被试材料浸提液、0.9%生理盐水；阳性对照动物注射环磷酰胺溶液,注射剂量为40mg/kg体重。试验时注意,每天注射时,应使所有动物几乎同步被注射。第二次染毒在第一次染毒后,间隔24小时再次染毒,注射剂量及方法同第一次染毒 。结果：(1)毒性表现观察：实验组及对照组动物在接受不同处理后呼吸、进食、尿便排泄等一般状态正常,无呕吐、惊厥、步态失稳、呼吸抑制等中毒表现,所用动物均未死亡或垂死,未观察到毒性表现。(2)实验组嗜多染红细胞在总红细胞中比例不低于对照组的20%,符合实验要求；(3)与阴性对照组相比,实验组微核率差异无统计学意义,而阳性对照组微核率差异有显著性意义结论：该实验条件下被试材料的浸提液对小鼠不会产生遗传毒性,即没有致突变作用。第八章肌肉内植入试验目的：植入后局部反应试验是评价生物材料和制品对活体组织的局部毒性作用。材料与方法：以2 ml/Kg注射量将3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射注射麻醉,在大鼠脊柱中线两侧约1cm处各选1个植入点,分离肌肉形成肌腔隙,植入被试材料(高10mm,直径3 mm圆柱体),每侧各植入1个,右侧植入实验组(含锶硫酸钙),左侧作为空白对照组(切开但不植入),术后动物连续3天肌注青霉素预防感染。结果：(1)整个实验过程中,没有出现排斥反应和全身毒性反应,动物术后第二天就活动自如,观察期内无任一动物死亡。(2)术后1周,炎性细胞反应程度为Ⅳ级,囊壁形成0级；术后4周,炎性细胞反应程度为Ⅱ级,囊壁形成为Ⅱ级；术后12周,炎性细胞反应程度为Ⅰ级,囊壁形成为Ⅰ级。结论：试验系统下该材料不存在潜在肌肉毒性。
【关键词】：含锶硫酸钙 迟发型超敏试验 细胞毒性试验 皮内刺激试验 急性全身毒性试验 亚急性全身毒性试验 肌肉内植入试验 红细胞微核试验
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;R687
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-22
• 第一章 新型含锶硫酸钙的制备22-24
• 1、试验材料和方法22
• 2、试验结果与结论22-24
• 第二章 皮内刺激反应试验24-31
• 1、实验材料和方法24-26
• 2、试验结果26-30
• 3、结果讨论30-31
• 第三章 迟发型超敏反应试验31-36
• 1、试验材料和方法31-33
• 2、试验结果33-34
• 3、讨论和结论34-36
• 第四章 体外细胞毒性试验36-42
• 1、实验材料和方法36-38
• 2、试验结果38-40
• 3、试验讨论40-42
• 第五章 急性毒性试验42-47
• 1、试验材料和方法42-44
• 2、试验结果44-45
• 3、讨论和结论45-47
• 第六章 亚急性全身毒性试验47-55
• 1、试验材料和方法47-48
• 2、试验结果48-52
• 3、结果讨论52-55
• 第七章 哺乳动物红细胞微核试验55-60
• 1、材料和方法55-57
• 2、试验结果57-58
• 3、结果讨论58-60
• 第八章 肌肉内植入试验60-63
• 1、试验材料和方法60-61
• 2、试验结果61-62
• 3、结果讨论62-63
• 参考文献63-66
• 综述66-79
• 参考文献73-79
• 攻读学位期间成果79-80
• 致谢80-81

【共引文献】

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本文编号：393483