清胰汤对SAP大鼠胰腺腺泡细胞的保护作用及其蛋白质组表达的影响

发布时间：2017-06-07 19:00

  本文关键词：清胰汤对SAP大鼠胰腺腺泡细胞的保护作用及其蛋白质组表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:从蛋白质组学方面研究重症急性胰腺炎(SAP)的病理机制,探讨清胰汤在治疗SAP过程中对大鼠胰腺腺泡细胞结构和功能的保护作用,以及对SAP早期胰腺腺泡细胞蛋白质组表达的影响;同时,在实验研究过程中对大鼠胰腺腺泡细胞分离、纯化及培养的技术方法进行完善和优化。方法:选择SPF级成年雄性Wistar大鼠69只,体重250~300g,按电脑随机数字表随机分为假手术组(9只)、SAP模型组(30只)、药物治疗组(30只)三组。SAP模型组和药物治疗组分别经胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型,假手术组以同样方法注射等剂量5%生理盐水。动物麻醉苏醒后,药物治疗组每隔12h灌胃清胰汤剂5ml(相当于30g原生药/kg),SAP模型组和假手术组每隔12h灌胃等剂量的生理盐水。各组分别在第一次灌胃清胰汤和生理盐水后24h、48h、72h三个时间点,在麻醉状态下分别消化大鼠胰腺组织,并经腹主动脉取血。通过将细胞分离液(胶原酶+胰蛋白酶抑制剂)进行胆胰管内逆行注射和体外消化,分别对胰腺腺泡细胞进行分离、提纯、体外培养,以及细胞存活率及纯化率测定;在透射电镜下比较三个时间点三组胰腺腺泡细胞及多种细胞器超微结构的差异;取48h时间点各组大鼠胰腺腺泡细胞,提取、纯化各组胰腺腺泡细胞内蛋白质,分别对各组提取的胰腺腺泡细胞蛋白质进行2-DE电泳,PDQuest软件对电泳图谱进行分析,然后选取有意义的差异显著、表达稳定且分辨率较好的蛋白质点胶内利用胰蛋白酶水解,将水解后的多肽进行MALDI-TOF-MS质谱分析,获得相应的肽质量指纹图谱(PMF),最后将MALDI-TOF-MS质谱数据用Mascot在线质谱分析数据检索工具通过互联网在免费的蛋白质数据库内进行检索,鉴定出表达稳定的差异蛋白质结果,并将SAP模型组和清胰汤药物治疗组的最终结果进行对比研究。结果:(1)透射电镜下观察,SAP模型组胰腺腺泡细胞及胞内细胞器,包括细胞核、线粒体、粗面内质网、高尔基体、酶原颗粒等出现明显的结构异常改变,且胞质内出现髓鳞体、空泡、溶酶体、次级溶酶体等病理结构,随着时间延长,腺泡细胞超微结构破坏程度不断加重;药物治疗组胰腺腺泡细胞超微结构病理改变程度明显轻于SAP模型组,且随着时间延长,腺泡细胞超微结构逐渐恢复,72h时间点观察到的胰腺腺泡细胞结构较完整,包括上述多种细胞器结构形态良好,细胞正常生理功能逐渐恢复。(2)三组2-DE凝胶电泳图谱中可见蛋白质点较多、且圆,分辨率较高,三张图谱具有一定的相似性,且差异点明显;对两个差异显著,表达稳定的蛋白质点进行分析:与假手术组相比,SAP模型组胰腺腺泡细胞的“差异蛋白质点30”的表达量上调17倍,SAP模型组胰腺腺泡细胞的“差异蛋白质点38”的表达量上调22倍。与SAP模型组相比,药物治疗组胰腺腺泡细胞的“差异蛋白质点30”的表达量下调约1/3,药物治疗组胰腺腺泡细胞的“差异蛋白质点38”的表达量下调约1/2;同时实验确定两种差异蛋白质分别是糜蛋白酶样蛋白和热休克蛋白。结论:(1)清胰汤具有保护SAP早期胰腺腺泡细胞结构完整,降低胞内线粒体、粗面内质网、高尔基体、酶原颗粒等多种细胞器的结构受损程度的作用;(2)SAP早期胰腺腺泡细胞异常表达的前体小分子蛋白质(糜蛋白酶样蛋白等)导致胰腺腺泡细胞正常功能失调,进而导致病情恶化发展;(3)清胰汤对SAP大鼠胰腺腺泡细胞内异常表达的小分子蛋白质(热休克蛋白等)具有调节作用,通过干预这些特异蛋白质的表达和修饰,从而达到治疗SAP的目的。
【关键词】：清胰汤 重症急性胰腺炎 胰腺腺泡细胞 蛋白质组 细胞超微结构
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语说明10-11
• 前言11-16
• 研究现状、成果11-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、正常大鼠胰腺腺泡细胞的分离、提纯及超微结构观察16-26
• 1.1 材料和方法16-21
• 1.1.1 主要设备16
• 1.1.2 主要试剂16-17
• 1.1.3 主要溶液配制17-18
• 1.1.4 实验动物18
• 1.1.5 方法步骤18-21
• 1.1.6 统计学处理21
• 1.2 结果21-24
• 1.2.1 新鲜分离的大鼠胰腺腺泡细胞21-22
• 1.2.2 原代细胞体外培养 12h的胰腺腺泡细胞22-23
• 1.2.3 台盼蓝染色测定细胞活性23
• 1.2.4 胰腺腺泡细胞纯化率23
• 1.2.5 透射电子显微镜技术观察胰腺腺泡细胞23-24
• 1.3 讨论24-25
• 1.4 小结25-26
• 二、清胰汤对SAP大鼠胰腺腺泡细胞的保护作用26-42
• 2.1 材料和方法26-29
• 2.1.1 主要设备26
• 2.1.2 主要试剂26-27
• 2.1.3 主要溶液配制27
• 2.1.4 实验动物27
• 2.1.5 方法步骤27-29
• 2.1.6 统计学处理29
• 2.2 结果29-38
• 2.2.1 各组各时间点血清淀粉酶测定29-30
• 2.2.2 各组各时间点血清脂肪酶测定30-31
• 2.2.3 各组胰腺腺泡细胞分离31-35
• 2.2.4 透射电子显微镜技术观察胰腺腺泡细胞形态学变化35-38
• 2.3 讨论38-41
• 2.3.1 联合测定血清淀粉酶、血清脂肪酶的重要意义38-39
• 2.3.2 清胰汤对胰腺腺泡细胞的保护作用39-41
• 2.4 小结41-42
• 三、清胰汤对SAP大鼠胰腺腺泡细胞蛋白质组的影响42-55
• 3.1 材料和方法42-49
• 3.1.1 主要设备42-43
• 3.1.2 主要试剂43-45
• 3.1.3 实验材料45
• 3.1.4 方法步骤45-49
• 3.2 结果49-52
• 3.2.1 胰腺腺泡细胞蛋白质的 2-DE电泳及图谱分析49-51
• 3.2.2 差异点蛋白质的MALDI-TOF-MS质谱分析及网上检索51-52
• 3.3 讨论52-54
• 3.4 小结54-55
• 结论55-56
• 参考文献56-59
• 发表论文和参加科研情况说明59-60
• 综述 SAP相关细胞因子的作用机制60-73
• 综述参考文献65-73
• 致谢73-74
• 个人简历74

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本文编号：429944