EDHF参与脑血管痉挛的机制研究

发布时间：2017-10-07 22:32

  本文关键词：EDHF参与脑血管痉挛的机制研究

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【摘要】：目的内皮源性的舒张因子主要包括:NO,PGI2以及EDHF,随着血管管径的变小,EDHF调节血管舒张的作用就愈发重要。EDHF调节血管的舒张作用依赖于正常的GJ通道功能,完成一个完整的EDHF反应依赖于各细胞间正常的缝隙连接介导的细胞间通讯(GJIC)功能,其中Cx40及其相关GJ通道对EDHF舒张血管的作用至关重要,沉默Cx40表达可使ACh激发的EDHF血管舒张作用减弱。前期研究表明:1、SAH后发生脑血管痉挛。2、SAH后Cx43较正常脑血管明显上升,Cx40上升不明显。3、Cx43 si RNA腺病毒可下调Cx43的表达改善脑血管痉挛以及缝隙连接阻断剂甘珀酸(CBX)同样可以改善脑血管痉挛。我们推测,SAH后EDHF调节脑血管舒张功能障碍而发生脑血管痉挛原因是脑血管Cx发生重构,Cx43与Cx40的比例失调,导致GJ通道功能改变,EDHF调节脑血管舒张的作用下降,随后发生脑血管痉挛。为此,本实验旨在:1、比较正常大鼠和SAH大鼠的基底动脉EDHF反应。2、利用Cx43 si RNA腺病毒下调Cx43的表达,CBX阻断SAH模型中的异常GJ通道,检测基底动脉中EDHF反应的变化,通过以上研究进一步明确EDHF参与SAH后脑血管痉挛的机理,为改善SAH的临床预后寻找新的有效方法。方法1、SAH模型的建立及鉴定:正常SD大鼠腹腔麻醉,尾静脉取血约0.3ml左右备用,显微镜下枕大池缓慢注射,24小时后进行二次注血,从而完成二次注血的蛛网膜下腔出血模型的建立。模型鉴定:取正常组,SAH3、7天大鼠基底动脉行HE染色。2、正常及SAH模型基底动脉EDHF反应以及Cx43的表达:1)取SD大鼠基底动脉环游离后先用含前列环素抑制剂吲哚美辛(Indo)和一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-硝基精氨酸(L-NAME)并通95%O2+5%CO2混合气体充分饱和的PSS液预处理,再用60mmol/L KCl KPSS刺激预收缩,最后加入不同浓度ACh(10-9-10-5mol/L),使基底动脉环产生EDHF反应,通过powerlab生理信息采集与处理系统记录各浓度ACh的张力值并计算出舒张百分比。2)取正常及SAH模型组SD大鼠进行体内多聚甲醛固定,再分离出基底动脉体外固定行石蜡包埋后,进行免疫组化检测,观察Cx43在基底动脉环中的表达情况。3、Cx43 si RNA腺病毒预处理SAH模型的EDHF反应及Cx43表达:1)Cx43腺病毒沉默效率的检测:Cx43 si RNA腺病毒、空病毒分别行枕大池注射,设立Cx43病毒处理组、空病毒组,于0(正常)、3、7、14天处死SD大鼠,通过基底动脉的Western blotting来检测Cx43 si RNA腺病毒的沉默效率。2)造SAH模型前一周,枕大池注射Cx43 si RNA腺病毒、空病毒对SD大鼠进行干预,预处理后再行SAH模型建立,最后检测Cx43 si RNA腺病毒、空病毒预处理SAH模型的EDHF反应以及免疫组化观察Cx43 si RNA腺病毒预处理SAH模型的Cx43的表达。4、甘珀酸预处理SAH模型后EDHF反应的变化:试验前取SAH模型组基底动脉用甘珀酸预处理30min,预处理完成后再行EDHF反应的测定。结果1、SAH模型基底动脉通过HE染色可见管腔变窄、内皮层增厚、皱缩明显,提示模型建立成功。2、Western blotting的结果显示:1)Cx43 si RNA腺病毒处理0(正常)、3、7、14天的Cx43蛋白表达情况为:0.796±0.02、0.604±0.03、0.369±0.04、0.394±0.01。其中病毒处理后3天Cx43表达下调(P0.05),有统计学意义;病毒处理7、14天后Cx43显著下降(P0.01)。2)空病毒处理0、3、7、14天的Cx43表达情况为:0.68±0.04、0.67±0.01、0.69±0.03、0.70±0.02,处理3、7、14天后Cx43表达无明显差异性(P0.05)。3、Cx43免疫组化的结果示:SAH后Cx43的阳性棕黄着色在内皮细胞、平滑肌细胞、外膜细胞均有不同程度上升;Cx43 si RNA腺病毒预处理SAH后,Cx43的阳性棕黄着色在平滑肌细胞、外膜细胞有一定的下降。4、游离血管环张力试验示:正常SD大鼠的基底动脉环张力实验中ACh激发EDHF反应引起的舒张反应最大的舒张百分比为41.084±5.459%;SAH组3、7天的最大舒张百分比为7.096±5.573%、5.142±2.579%与正常组比有显著的差异(P0.05);空病毒预处理SAH3、7天组最大舒张百分比为7.722±4.516%、8.714±2.641%与SAH模型组比差异不明显(P0.05);Cx43 si RNA腺病毒预处理SAH3、7天组最大舒张百分比为51.268±14.072%、50.284±5.572%与SAH模型组比有显著差异(P0.05);甘珀酸预处理SAH3、7天组最大舒张百分数分别为41.924±6.246%、42.50±13.693%与SAH模型组比有显著的差异(P0.05)。结论1、SAH后脑血管痉挛的发生发展与EDHF舒张作用减弱有关。2、SAH后EDHF舒张功能减弱与Cx43上升后Cx43与Cx40比例失调,GJ重构,GJ通道功能障碍有关。3、甘珀酸抑制SAH后异常重构的GJ通道,EDHF舒张血管功能得到恢复,CVS得到缓解。4、通过Cx43 si RNA腺病毒下调Cx43的表达,逆转SAH后GJ重构,改善GJ通道功能,EDHF舒张血管功能得到恢复,CVS得到缓解。
【关键词】：EDHF SAH GJ重构 siRNA 血管环张力
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.35
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英缩略词表12-13
• 第1章 前言13-15
• 第2章 材料与仪器15-20
• 2.1 实验动物15
• 2.2 实验试剂15-18
• 2.2.1 主要购置试剂15-16
• 2.2.2 主要试剂的配制16-18
• 2.3 实验仪器18-20
• 第3章 实验方法20-29
• 3.1 蛛网膜下腔出血模型的建立20
• 3.2 HE染色对蛛网膜下腔出血模型的鉴定20-22
• 3.2.1 石蜡切片的制作20-21
• 3.2.2 标本进行脱蜡并染色镜检21-22
• 3.3 腺病毒及甘珀酸预处理模型的建立22
• 3.4 腺病毒沉默效率的检测22-25
• 3.4.1 样品总蛋白制备22-23
• 3.4.2 样品蛋白含量测定23
• 3.4.3 配胶23
• 3.4.4 灌胶和上样23
• 3.4.5 垂直电泳23-24
• 3.4.6 转膜24
• 3.4.7 样品蛋白免疫反应24
• 3.4.8 蛋白化学发光及曝光24-25
• 3.4.9 膜再生25
• 3.4.10 内参蛋白 β-actin免疫反应25
• 3.4.11 图像分析25
• 3.5 体内试验的分组25-26
• 3.6 免疫组化检测Cx43 的表达26
• 3.6.1 石蜡切片的制作26
• 3.6.2 切片标本脱蜡、抗体孵育、镜检26
• 3.7 游离血管环张力测定26-28
• 3.7.1 启动powerlab26-27
• 3.7.2 游离大鼠离体基底动脉环的制备及安装27
• 3.7.3 游离基底动脉环的EDHF反应引起舒张的变化曲线。27-28
• 3.8 数据统计分析28-29
• 第4章 实验结果29-35
• 4.1 SAH模型的鉴定29
• 4.2 Cx43 siRNA腺病毒沉默效率的检测29-30
• 4.3 Cx43 免疫组化结果30
• 4.4 游离血管环张力试验结果30-35
• 第5章 讨论35-41
• 5.1 内皮依赖性超极化因子35-36
• 5.2 内皮依赖性超极化因子与血管舒张36-37
• 5.2.1 内皮依赖性超极化因子与K+通道36
• 5.2.2 内皮依赖性超极化因子与缝隙连接36-37
• 5.3 蛛网膜下腔出血后缝隙连接蛋白重构与EDHF反应的变化37-38
• 5.4 缝隙连接蛋白重构与EDHF反应变化机制的初步探讨38-39
• 5.5 存在的问题39-41
• 第6章 结论与展望41-42
• 6.1 结论41
• 6.2 展望41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-46
• 附图46-49
• 综述49-54
• 参考文献51-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 吴远水;洪涛;;缝隙连接在心脑血管疾病中的研究进展[J];江西医学院学报;2009年03期

2 洪涛;冯九庚;蒋丽萍;段剑;汪阳;江志群;;RNA干扰抑制血管平滑肌细胞缝隙连接Cx43介导的细胞间通讯[J];中华实验外科杂志;2006年06期

3 洪涛,汪阳,蒋丽萍,高子云,辜斌,迟海波;缝隙连接阻断剂1-庚醇对脑血管痉挛的抑制作用[J];中华神经外科杂志;2005年04期

4 洪涛,Hill CE;缝隙连结在蛛网膜、软脑膜及血管浆膜层中的表达[J];中华实验外科杂志;2003年05期

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本文编号：990478