FC-99通过抑制DCs分泌BAFF缓解狼疮性肾炎的机制研究

发布时间：2017-04-04 22:06

  本文关键词：FC-99通过抑制DCs分泌BAFF缓解狼疮性肾炎的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的自身免疫病,并伴随有不同的临床表现。狼疮性肾炎(LN)是引起SLE患者死亡的主要原因。越来越多的证据表明,LN患者体内有过度活化的循环B细胞和失去对自身抗原耐受性的B细胞,且自身抗体的沉积和多种免疫细胞的活化可以促进LN的发病进程。因此,B细胞被认为是治疗LN的重要靶点之一。B细胞活化因子(BAFF)是肿瘤坏死家族成员之一,对B细胞的增殖、活化及抗体分泌有重要作用。值得注意的是,可溶性的BAFF在SLE患者血清以及狼疮小鼠器官中都是高表达。许多类型的细胞包括单核细胞和树突状细胞(DCs)都可以产生BAFF,但是SLE患者BAFF被认为主要来源于髓样DCs。DCs在LN的早期被激活,活化的DCs可以通过分泌型的BAFF增强B细胞的功能,并参与LN疾病发展。重要的是,TLR4通路已经被证明在LN的发病进程中起关键作用。TLR4通路活化后,DCs可以产生并分泌BAFF。前期我们的实验证明,小分子化合物FC-99具有保护实验性脓毒症损伤和诱导性肠炎的作用。我们前期还发现,FC-99可直接与IRAK4相互作用,而IRAK4在TLR4激活DCs活化中起着重要作用。因此,我们推测FC-99可以通过靶向IRAK4抑制DCs活化从而缓解LN。然而,关于FC-99能否影响DCs的活化及其BAFF的表达以及是否对SLE小鼠的LN具有疗效果迄今未见报道。因此,本研究分析了FC-99缓解MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的效果；评价了FC-99对TLR4刺激后DCs分泌BAFF的影响；揭示了FC-99抑制DCs分泌BAFF的作用机制。(1)发现FC-99可缓解MRL/lpr狼疮小鼠的狼疮性肾炎：我们首先利用MRL/lpr狼疮小鼠模型,探究了FC-99对狼疮性肾炎疾病进程的影响。发现FC-99可降低第20周的SLE小鼠尿蛋白的水平以及抑制1肾脏淋巴细胞浸润、IgG和C3c沉积以及炎性因子的产生；FC-99还可减少MRL/lpr小鼠血清中自身抗体IgG、IgM和IgG2a的水平。这些结果表明,FC-99具有缓解MRL/lpr小鼠LN的作用。(2)发现FC-99可抑制LPS诱导的DCs活化及其BAFF产生：已知自身抗体主要是由B细胞产生,我们推测FC-99可以抑制B细胞活化。因此,我们检测了FC-99处理组小鼠与空白对照组小鼠脾脏中B细胞的比例、活化及成熟的变化情况。结果表明,FC-99处理组小鼠脾脏总B细胞的百分比、活化B细胞的百分比以及成熟B细胞的百分比都显著降低；FC-99还可减少成熟B细胞表面活化标志CD40和CD86的表达。以上结果表明,FC-99是通过抑制DCs产生BAFF减少自身抗体的产生来缓解狼疮性肾炎。众所周知,活化的DCs通过TLR4/IRAK4/NF-KB通路产生。为探究FC-99能否影响BAFF的产生,我们体外检测FC-99对LPS诱导的DCs活化的影响。结果表明,FC-99不仅可以显著降低细胞活化表面标志CD40、CD86、MHCⅡ和CD80的表达还可以显著降低BAFF的mRNA表达水平和蛋白表达水平。进一步,由于BAFF可以促进B细胞活化,我们推测FC-99预处理的DCs可以影响B细胞的增殖与活化。我们的结果显示,FC-99预处理的DCs与B细胞共同培养,可以显著抑制B细胞增殖活化。而且,BAFF中和抗体可以明显消除这种作用。更重要的是,FC-99既不能直接抑制B细胞活化也不能直接抑制B细胞增殖。以上结果表明,FC-99是通过减少BAFF产生,抑制B细胞活化。(3)发现FC-99通过抑制IRAK4磷酸化降低LPS诱导的DCs活化及其BAFF产生：我们前期发现,FC-99可抑制巨噬细胞RAW264.7的IRAK4磷酸化以及下游信号转导。为了检测FC-99能否影响DCs的IRAK4磷酸化,DCs用100ng/mlLPS处理15分钟,然后利用Western Blotting分析。接着我们检测了下游NF-κB通路和MAPK通路的活化情况,结果发现,LPS可通过抑制IκBα磷酸化影响LPS诱导的DCs细胞NF-κB通路的活化。进一步我们发现,FC-99可以通过减少p-38、P-JUK和P-ERK的磷酸化水平抑制LPS诱导的DCs细胞MAPK通路的活化。综上所述,FC-99可抑制DCs的IRAK4磷酸化及其BAFF的产生,进而导致B细胞活化的降低,从而缓解MRL/lpr狼疮小鼠LN的发病进程。我们的研究结果提示,FC-99可能是一个治疗LN的潜在小分子化合物。
【关键词】：FC-99 狼疮性肾炎 树突状细胞 B细胞活化因子 B细胞
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.242
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略词表12-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 FC-99缓解狼疮性肾炎的发病进程17-25
• 1.1 引言17-18
• 1.2 实验材料18-19
• 1.2.1 实验对象18
• 1.2.2 主要试剂18
• 1.2.3 主要仪器设备18-19
• 1.3 实验方法19-21
• 1.3.1 实验动物分组19
• 1.3.2 FC-99治疗小鼠狼疮性肾炎19
• 1.3.3 小鼠尿蛋白浓度统计19
• 1.3.4 ELIAS检测小鼠自身抗体沉积情况19-20
• 1.3.5 小鼠血清炎性因子的检测20
• 1.3.6 实时定量PCR20-21
• 1.3.7 数据分析21
• 1.4 实验结果与分析21-23
• 1.4.1 FC-99缓解MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎21-23
• 1.5 讨论23-25
• 第三章 FC-99可抑制LPS诱导的DCS活化及其BAFF产生25-44
• 2.1 引言25
• 2.2 实验材料25-27
• 2.2.1 实验对象25-26
• 2.2.2 主要实验试剂26
• 2.2.3 实验仪器和设备26-27
• 2.3 实验方法27-32
• 2.3.1 流式分析27
• 2.3.2 FC-99的配置27
• 2.3.3 骨髓细胞的制备和髓样树突状细胞的培养27-28
• 2.3.4 CCK-8法检测细胞活力28-29
• 2.3.5 流式细胞术检测DCs活化的表面标志29
• 2.3.6 Q-PCR检测髓样树突状细胞炎症因子的表达29-31
• 2.3.7 ELISA检测DCs培养上清中BAFF的表达31-32
• 2.3.8 数据统计分析32
• 2.4 实验结果32-41
• 2.4.1 FC-99减少MRL/lpr小鼠脾脏中B细胞的百分比,活化和成熟32-35
• 2.4.2 FC-99抑制MRL/lpr小鼠DCs活化35-37
• 2.4.3 FC-99的化学结构及其对DC活力的影响37-38
• 2.4.4 FC-99可抑制TLR4信号诱导的DCs活化38-39
• 2.4.5 FC-99可以抑制LPS-诱导的DCs分泌BAFF39-40
• 2.4.6 FC-99通过减少DCs分泌BAFF抑制B细胞活化40-41
• 2.5 讨论41-44
• 第四章 FC-99通过抑制IRAK4磷酸化降低LPS诱导的DCS活化及BAFF产生44-51
• 3.1 引言44
• 3.2 实验材料44-45
• 3.2.1 实验对象44-45
• 3.2.2 主要试剂45
• 3.2.3 主要仪器设备45
• 3.3 实验方法45-47
• 3.3.1 Western blot45-47
• 3.4 数据分析47
• 3.5 实验结果47-49
• 3.5.1 FC-99可以抑制IRAK4磷酸化水平48
• 3.5.2 FC-99对DCs细胞NF-κB通路和MAPK通路的影响48-49
• 3.6 讨论49-51
• 结论51-52
• 参考文献52-58
• 附录58-62
• 硕士期间科研成果62-63
• 致谢63-64

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