尿毒症血清蛋白对血管内皮细胞的损伤作用

发布时间：2017-05-17 15:03

  本文关键词：尿毒症血清蛋白对血管内皮细胞的损伤作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:最新统计数据表明,成年慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)的患病率已超过了10%,由CKD导致的终末期肾衰也在逐年增长[1]。随着肾功能逐渐减退,患者会出现各种并发症。流行病学结果示,即使在肾功能轻度损伤的患者,心、脑血管疾病的发病率就较同年龄、同性别的非肾脏病人群显著增高,心、脑血管事件是尿毒症患者最常见的并发症和致死原因[2-4]。研究发现尿毒症毒素是促使CKD患者心、脑血管疾病高患病率的独立危险因素[5,6]。尿毒症毒素分为蛋白结合尿毒症毒素和游离毒素,游离毒素能被透析清除,而蛋白结合毒素却不能通过常规透析清除,随着时间的推移,蛋白结合毒素会在体内蓄积,引起组织细胞损伤。由于血液内的蛋白结合毒素与血管内皮细胞接触的机会多,故极有可能引起内皮细胞损伤。内皮细胞的形态和功能正常是避免各种血管疾病发生的基础;内皮细胞结构受损、功能不全是血管疾病发生的关键环节[7]。国内外大量研究证实,游离的硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚等毒素能通过氧化应激反应等机制导致血管内皮的损伤,进而促使血管疾病的发生[8-11]。然而蛋白结合的尿毒症毒素是否也能导致血管内皮的损伤,目前尚无这方面文献报道。目的:本研究观察体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)被尿毒症患者血清蛋白刺激后的增殖能力、一氧化氮分泌量、一氧化氮合酶活性、内皮源性膜微粒脱落率以及凋亡等指标;探讨蛋白结合尿毒症毒素(protein-bound uremic toxins,PBUTs)对人血管内皮细胞的损伤作用。方法:选取第三军医大学新桥医院肾内科透析室维持性血液透析的尿毒症患者20例(男女各10例)和第三军医大学新桥医院健康管理科健康志愿者20例(男女各10例),每例各抽取静脉全血10ml,经过血清分离、透析、低温真空冻干等处理后提取血清蛋白[12],用细胞培养基将血清蛋白配制成0.4%、1.0%、2.0%、4.0%四种浓度,以尿毒症血清蛋白溶液(0.4%、1.0%、2.0%、4.0%)、正常血清蛋白溶液(0.4%、1.0%、2.0%、4.0%)刺激HUVEC细胞,设置空白对照组,刺激24h、48h、72h共3个实验时间点,检测以下指标:1)cck-8法测定尿毒症血清蛋白对huvec细胞的增殖能力的影响;2)倒置相差显微镜观察尿毒症血清蛋白对huvec细胞的形态的影响;3)一氧化氮试剂盒(硝酸还原酶法)测定尿毒症血清蛋白对huvec细胞分泌一氧化氮量的影响;4)一氧化氮合成酶检测试剂盒(荧光法)测定尿毒症血清蛋白对huvec细胞一氧化氮合酶活性的影响;5)用cd144抗体经流式细胞仪检测尿毒症血清蛋白对huvec细胞的内皮源性膜微粒脱落率的影响;6)用annexinv/pi双染细胞凋亡试剂盒经流式细胞仪和dapi染核法检测尿毒症血清蛋白对huvec细胞凋亡的影响。结果:1.尿毒症血清蛋白对huvec细胞增殖能力的影响在相同实验时间点(24h、48h或者72h),尿毒症组huvec细胞od值,均比空白对照组以及相同浓度的正常组明显降低(p0.05);在相同实验时间点(24h、48h或者72h),随着血清蛋白溶液浓度的增加,与相同浓度的正常组相比,尿毒症组huvec细胞od值均明显减低,呈现浓度依赖性(p0.05);对于相同浓度的血清蛋白溶液,随实验时间的延长,与正常组相比,尿毒症组huvec细胞od值均明显减低,呈现时间依赖性(p0.05)。2.尿毒症血清蛋白对huvec细胞形态的影响空白组huvec细胞,细胞大小均一、边界清晰,呈短梭形、单层鹅卵石样铺列;正常组的huvec细胞,细胞大小稍不均一,细胞膜表面欠光滑,细胞触角、突起增多;可观察到细胞分泌的胞浆颗粒增多;尿毒症组的huvec细胞,细胞生长状态差,大小明显不均一,细胞间隙明显增宽,细胞膜表面粗糙,细胞触角、突起明显增多,部分触角、突起交织呈网状,观察到细胞分泌的胞浆颗粒明显增多。3.尿毒症血清蛋白对huvec细胞一氧化氮分泌的影响干预72h后,空白组huvec细胞no的分泌量约为(13.24±0.32)umol/l,0.4%、1.0%、2.0%、4.0%正常组huvec细胞no的分泌量约为(12.68±0.55)umol/l、(10.10±0.30)umol/l、(7.86±0.49)umol/l、(7.40±0.14)umol/l;0.4%、1.0%、2.0%、4.0%尿毒症组huvec细胞no的分泌量约为(9.46±0.29)umol/l、(6.64±0.28)umol/l、(5.42±0.50)umol/l、(3.92±0.34)umol/l;随着血清蛋白溶液浓度呈梯度增加,尿毒症组HUVEC细胞的NO分泌量逐渐减少,且呈现浓度依赖性(P0.05)。4.尿毒症血清蛋白对HUVEC细胞一氧化氮合酶活性的影响干预72h后,空白组HUVEC细胞NOS合酶活性OD值约为(192.39±3.69),0.4%、1.0%、2.0%、4.0%正常组HUVEC细胞NOS合酶活性OD值约为(184.39±4.58)、(169.33±7.33)、(151.83±3.95)、(148.68±3.20);0.4%、1.0%、2.0%、4.0%尿毒症组HUVEC细胞NOS合酶活性OD值约为(142.91±4.50)、(128.67±5.10)、(113.98±3.17)、(59.42±3.74);尿毒症组OD值明显下降,与空白组、正常组差异具有统计学意义(P0.05);随着血清蛋白溶液的浓度呈梯度增加,尿毒症组HUVEC细胞的NOS合酶活性OD值明显降低;且呈现浓度依赖性(P0.05)。5.尿毒症血清蛋白对HUVEC细胞内皮源性膜微粒脱落率的影响干预72h后,空白组、4.0%正常组、4.0%尿毒症组EMPs的脱落率分别为(7.30±0.57)%、(13.0±0.94)%、(62.57±1.59)%,与空白对照组、正常组相比,尿毒症组EMPs脱落率明显升高(P0.05)。6.尿毒症血清蛋白对HUVEC细胞凋亡的影响干预72h后,空白组、4.0%正常组和4.0%尿毒症组细胞凋亡率分别为(4.44±1.74)%、(5.49±1.57)%、(6.2±1.17)%,各组间比较差异无统计学意义。结论:尿毒症血清蛋白能抑制HUVEC细胞增殖、抑制其分泌NO、促进其EMPs脱落,导致HUVEC细胞损伤,提示蛋白结合尿毒症毒素是心脑血管并发症的重要诱发因素之一。
【关键词】：蛋白结合尿毒症毒素 人脐静脉内皮细胞 一氧化氮 一氧化氮合酶 内皮膜微粒 细胞凋亡
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692.5
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料方法14-24
• 结果24-34
• 讨论34-36
• 全文结论36-37
• 参考文献37-40
• 文献综述 蛋白结合尿毒症毒素的研究进展40-50
• 参考文献45-50
• 攻读学位期间发表的论文50-51
• 致谢51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 袁发焕;李莉;庞芳;;硫酸对甲酚的毒性及其清除措施研究进展[J];中国中西医结合肾病杂志;2012年09期

2 李洪,黄烈诚;尿毒症毒素研究进展与血液吸附的再应用[J];中国血液净化;2004年08期

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本文编号：373717