晚期氧化蛋白产物诱导小肠上皮细胞钙转运通道表达减少的作用及其机制

发布时间：2017-05-23 13:14

  本文关键词：晚期氧化蛋白产物诱导小肠上皮细胞钙转运通道表达减少的作用及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的：晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)在1996年首次由Wtko-Sarsat等人在长期透析的尿毒症患者的血浆中发现,是氧化蛋白化合物的新成员。它是一种由血浆蛋白和氯化氧化剂如次氯酸(HC10)反应后含双酪氨酸的蛋白交联物,在吸光度为340nm时有两个特定的可视吸收峰,对应的分子量分别是60KDa和600KDa。在体外,用HC10作用于纯化的血清白蛋白或血浆可得到与尿毒症患者血浆中类似的AOPPs。目前,AOPPs己被认为是氧化应激过程(Oxidative stress,OS)中蛋白质的最终氧化产物,是一种良好的氧化损伤的敏感标志物。研究表明,AOPP相对OS其他标志物如晚期糖化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)、晚期脂质过氧化终末产物(advanced lipoperoxidation end products,ALEs),是更敏感的OS指标,且更能反映急性OS过程。AOPPs不仅是氧化损伤的新型标志物,其本身更是一种炎性介质,参与人类多种疾病的发生与发展。AOPPs可以在体内外刺激中性粒细胞及单核细胞的呼吸爆发,促进合成、释放大量促炎性细胞因子,如白细胞介素(IL)1、TNF-α等,诱发全身微炎症反应。TNF-α不但可通过诱导细胞凋亡参与急性肝衰竭的发病过程,还可以通过多种途径介导肝细胞的损伤。AOPPs还可以诱导人内皮细胞炎症反应,进而促进糖尿病、慢性肾衰竭及动脉粥样硬化的发生与发展。研究证实,炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)患者血清的AOPPs水平较健康人的显著增高,且在克罗恩病(Crohn's disease,CD)患者中AOPPs水平与疾病活动有关。骨质疏松(Osteoporosis,OP)是一种以骨量下降和骨组织的微细结构破坏为特征的系统性骨病。在上个世纪70年代已有文献报道,IBD患者容易出现骨质疏松,继而骨折的发生率增加。Almenier等提出OS(氧化／抗氧化系统的失衡)与IBD的发展及其并发OP密切相关,但具体致病机制尚不明确。研究报道AOPPs的累积是IBD患者体内OS过程中新型的氧化标志物,但它在IBD患者中并发OP的病理机制仍不清楚。小肠钙离子吸收的减少是导致骨量丢失甚至OP发生的重要原因之一。钙离子吸收的主要部位发生在近端小肠(十二指肠和近端空肠),而钙离子吸收的方式主要分为跨细胞膜被动吸收与跨细胞膜主动转运,通常认为主动转运途径是近端小肠钙离子吸收的主要方式。主动转运主要由以下三步完成：(1)小肠上皮顶端刷状缘膜上瞬时受体电位香草酸受体(transient receptor potential vanilloid,TRPV) 5/6、电压依赖性L型钙通道(voltage-dependent L-type calcium channel, CaV1.3)的开放吸收钙离子进入细胞内；(2)胞浆内钙结合蛋白(calcium binding protein, CaBP-D9k)结合钙离子并运输至细胞基底侧；(3)细胞质膜钙ATP酶(plasma membrane calcium ATPase, PMCA1)和浆膜侧钠钙交换器(sodium calcium exchanger1,NCX1)。同时,血清钙离子的平衡受相关激素如甲状旁腺素(Parathyroid hormone, PTH)、25-羟基维生素D3 [25-(OH)D3]和1,25-二羟基维生素D3 [1,25-(OH)2D3]的调节。AOPPs血清水平在IBD患者中显著增高,但它在IBD并发OP的病理学机制尚不明确,是否通过下调小肠上皮钙转运通道(Calcium transport channels, CTCs)的表达而减少血清钙离子浓度,从而引起OP?是否影响PTH、25-(OH)D3和1,25-(OH)2D3的分泌而调节钙离子平衡,引起骨量的丢失?因此,本研究完成以下三个目标：(1)证实AOPPs对小肠上皮钙转运通道表达的调控作用；(2)探讨AOPPs对血清钙离子及其相关调节激素的作用；(3)明确AOPPs作用的机制。材料和方法：1.无内毒素AOPPs的制备与测定。按照Witko-Sarsat等介绍的方法,在体外将20 mg/mL的无内毒素大鼠白蛋白(RSA)与40 mmol/L的次氯酸(HC10)等体积混合,混匀后在室温孵育30min,即制备出RSA:HClO摩尔比为1：140的AOPPs。制备的AOPPs用无内毒素的磷酸盐缓冲液(PBS)在4℃下连续透析24 h,以去除游离的HClO。再用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,并放在-200C保存。20mg/mL RSA与PBS等体积混合,作为对照。AOPPs浓度的测定：以不同浓度氯胺T制备标准曲线,测定酸性条件下340 nm处吸光值。通过鲎试验法检测,该方法制备的AOPPs无内毒素。2.细胞培养。肠上皮Caco-2细胞株购自上海细胞库。培养条件：用含10%胎牛血清、1000U/L青霉素及100mg/L链霉素的高糖DMEM培养基置于含5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养,待细胞生长融合至90%时用于实验。3. Caco-2细胞钙转运通道表达的检测。Caco-2细胞以1×105每孔接种于6孔细胞培养板,等细胞培养融合至90%后换成无血清DMEM培养基培养过夜,使细胞同步于Go期。分组如下：(1)以0,100μg/mL RSA,100,200,400,600μg/mL AOPPs刺激24h；(2)以400μg/mL AOPPs刺激0,1,3,6,12,24h。AOPPs刺激完成后,提取细胞总蛋白和细胞RNA,分别用Western blotting和Quantitative real time-PCR检测各组钙转运通道(CaV1.3、TRPV6、CaBP-D9k、PMCA1和NCX1)蛋白水平和mRNA水平。4.免疫荧光检测。Caco-2细胞以5×104每孔接种于24孔细胞培养板,待细胞接近融合后换成无血清DMEM培养基培养过夜,使细胞同步于G0期,分别以0,100μg/mL RSA, 400μg/mL AOPPs刺激24h。刺激结束,用多聚甲醛固定、Triton X-100透膜、5%BSA封闭、一抗(抗-CaBP-D9k、抗-PMCA1)孵育及二抗避光孵育后,荧光显微镜下观察各组细胞的荧光强度,立即拍照、存像。5.p44/42和.JNK磷酸化的检测。Caco-2细胞接种于6孔细胞培养板,用400μg/mL AOPPs分别刺激0,5,10,15,20,30,60,120,180 min,收集细胞总蛋白,Western blotting检测p.p44/42、p44/42、p-JNK、JNK蛋白的表达。6. p44/42 MAPK和JNK MAPK抑制剂对钙转运通道表达作用的检测。Caco-2细胞接种于6孔细胞培养板,分别用p44/42 MAPK和JNK MAPK的特异性抑制剂U0126和SP60025预孵育60 min,再用400μg/mL AOPPs刺激24h,提取细胞总蛋白,Western blotting检测钙转运通道(TRPV6、CaBP-D9k、 PMCA1和NCX1)的蛋白表达水平。7.动物实验。雄性正常SD大鼠(体重160-200g,购自南方医科大学实验动物中心),在恒温清洁的环境(南方医科大学实验动物中心)中饲养,可自由进食及饮水,随机分成3组,每组6只,分别作以下处理：(1)溶剂组：等体积PBS,腹腔注射,每天一次;(2)未修饰的RSA组：50mg/kg,腹腔注射,每天一次；(3)AOPPs组：50mg/kg,腹腔注射,每天一次。于注射8周时处死大鼠取材。大鼠经七氟醚麻醉后,迅速取血及取出近端小肠组织。部分肠组织迅速放于液氮中,以提取蛋白和mRNA,分别进行Western blotting和RT-PCR实验。部分肠组织4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,3-4gm切片,进行免疫组化检测。8.血清生化分析。SD大鼠处死后,收集血清。用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清钙离子、钠离子和氯离子浓度,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血清甲状旁腺素(PTH)、25-羟基维生素D3和1,25-二羟基维生素D3的水平。9.大鼠Western blotting检测。大鼠处死后,提取组织蛋白,使用化学发光法检测TRPV6、CaBP-D9k、 PMCA1、NCX1、p-p44/42及p44/42等蛋白的表达。10.大鼠RT-PCR实验。大鼠处死后,提取组织RNA,采用RT-PCR方法检测TRPV6、CaBP-D9k、 PMCA1和NCX1等mRNA的表达。11.免疫组化实验。大鼠小肠组织标本经脱蜡、水化及抗原修复、阻断过氧化物酶及血清封闭后,孵育p-p44/42一抗及相应的二抗,最后经DAB染色,检测p44/42的磷酸化情况。12.统计学方法。全部实验均重复3次或3次以上,结果用均数士标准差表示。多个样本均数的比较采用one-way ANO VA(方差齐时用)或者Welch ANO VA(方差不齐时用)。当方差齐时两两比较时采用Bonferroni方法,否则采用Dunnett's T3法。当P0.05时定义为具有统计学差异。以上统计结果应用SPSS 13.0软件完成。结果：1. AOPPs减少肠上皮Caco-2细胞株钙转运通道(CTCs)的表达。Western blotting及Quantitative real time-PCR结果显示,AOPPs减少了TRPV6、CaBP-D9k、PMCA1和NCX1的蛋白及mRNA表达水平,随着刺激浓度及时间的增加,AOPPs对以上CTCs的蛋白和mRNA表达的减少作用越明显,经统计学分析表明：AOPPs组与对照组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。然而,Wetern blotting结果显示,AOPPs对CaV1.3的蛋白表达无影响,各组间无统计学差异(P0.05)。另外,通过免疫荧光实验检测,观察到AOPPs刺激组中CaBP-D9k和PMCA1的荧光强度均弱于对照组,以上结果均提示AOPPs减少了Caco-2细胞钙转运通道的表达。2. AOPPs诱导Caco-2细胞内p44/42和JNK MAPK磷酸化。在AOPPs刺激下,Caco-2细胞内的p44/42和JNK均快速磷酸化。其中,p44/42 MAPK磷酸化发生在AOPPs刺激15 min后,并在60 min后开始回到正常水平。而JNK MAPK磷酸化则在AOPPs刺激10 min后就开始,并在120 min后降至正常水平。3. AOPPs通过p44/42 MAPK信号通路减少钙转运通道的表达。为了进一步探讨AOPPs诱导钙转运通道表达减少与MAPK通路的关系,在AOPPs刺激Caco-2细胞前,我们先分别用p44/42 MAPK的特异性抑制剂U0126和JNK MAPK的特异性抑制剂SP600125预孵育1h或者与Caco-2细胞一直共孵育,再用Western blotting检测TRPV6、CaBP-D9k、PMCA1和NCX1的蛋白表达情况。结果显示,与AOPPs组相比,U0126能抑制AOPPs对钙转运通道表达减少的作用,其中对CaBP-D9k的抑制作用最明显,但是SP600125对钙转运通道的表达作用与AOPPs组相比,差异无统计学意义。以上结果表明AOPPs减少肠上皮Caco-2细胞上钙转运通道表达的作用是通过p44/42 MAPK信号通路而不是JNK MAPK途径。4.大鼠体重、血清钙离子浓度及调节钙离子的相关激素水平的变化。所有实验大鼠均存活,各组实验大鼠间的体重无统计学差异(n=6)。注射8周后,AOPP-RSA处理组与PBS注射组及未修饰的RSA组对比,AOPP-RSA组大鼠血清中钙离子、钠离子及氯离子浓度均无变化,而甲状旁腺素、25-羟基维生素D3和1,25-二羟基维生素D3的水平均增加。但是,AOPPs诱导甲状旁腺素增加的水平不具有统计学意义。5. AOPPs减少大鼠十二指肠上皮钙转运通道的表达。上述结果己证实AOPPs在体外可诱导肠上皮Caco-2细胞株的钙转运通道表达下降,为了验证AOPPs在体内的累积作用,我们用Sprague-Dawley (SD)大鼠为研究模型,应用Western blotting和RT-PCR技术检测其十二指肠上皮钙转运通道的表达情况,结果显示：AOPPs刺激后,大鼠十二指肠上皮钙转运通道TRPV6、CaBP-D9、PMCA1和NCX1的蛋白及mRNA水平均较PBS注射组及未修饰的RSA组表达下降,差异具有统计学意义。6. AOPPs激活大鼠十二指肠上皮p44/42 MAPK。为了验证在体内AOPPs能否激活p44/42 MAPK通路,我们对大鼠十二指肠组织进行免疫组化原位检测和十二指肠组织匀浆蛋白进行western blotting分析。结果均显示：与对照组相比,AOPPs注射组大鼠十二指肠上皮的p44/42显著磷酸化。结论：1. AOPPs以时间和剂量依赖性的方式诱导肠上皮Caco-2细胞株的钙转通道TRPV6、CaBP-D9k、PMCA1和NCX1表达减少,而对CaV1.3无影响。2. AOPPs通过激活p44/42 MAPK信号通路从而下调Caco-2细胞钙转运通道TRPV6、CaBP-D9k、PMCA1和NCX1的表达水平。3. AOPPs对SD大鼠血清钙离子浓度无影响,但增加了调节钙离子平衡的相关激素PTH、25-(OH)D3和1,25-(OH)2D3的分泌。4.动物学实验同样证实AOPPs能减少十二指肠上皮钙转运通道TRPV6、 CaBP-D9k、PMCA1和NCX1的表达,并且诱导p44/42在十二指肠粘膜上皮细胞上明显磷酸化。
【关键词】：晚期氧化蛋白产物 钙离子 钙转运通道 小肠上皮 MAPK
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692.5
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-23
• 第一章 AOPPs对体外培养的肠上皮Caco-2细胞株上钙转运通道表达的影响及作用机制23-59
• 前言23-26
• 1 材料与试剂26-33
• 2 实验方法33-46
• 3 结果46-56
• 4 讨论56-59
• 第二章 AOPPs对Sprague-Dawley大鼠十二指肠上皮钙转运通道表达的作用及机制59-83
• 前言59-61
• 1 材料与试剂61-64
• 2 实验方法64-76
• 3 结果76-79
• 4 讨论79-83
• 全文结论83-84
• 参考文献84-89
• 攻读学位期间的成果89-91
• 致谢91-92

【共引文献】

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本文编号：388051