细胞粘附分子1对膀胱癌增殖侵袭的影响及其机制研究

发布时间：2017-07-16 08:29

  本文关键词：细胞粘附分子1对膀胱癌增殖侵袭的影响及其机制研究

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【摘要】：目的:我们前期研究发现CADM1/TSLC1在膀胱尿路上皮癌中表达降低甚至缺失,且与病理分级呈负相关。为进一步探讨CADM1在膀胱尿路上皮癌中表达降低的机制,并探讨CADM1过表达后对膀胱癌细胞系细胞增殖、侵袭、及凋亡的影响,为阐明CADM1基因在膀胱癌发生发展中的功能及其可能机制奠定研究基础。方法:1、甲基化特异性PCR技术(MSP)检测84例膀胱尿路上皮癌中CADM1基因启动子区CpG岛甲基化状态,同时选取20例正常膀胱黏膜组织作为对照;WB检测CADM1蛋白表达情况,分析CADM1基因启动子CpG岛甲基化状态与临床病理参数和蛋白表达量之间的关系。2、构建CADM1过表达和干扰慢病毒载体并稳定转染人膀胱癌T24细胞系,获得Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh RNA-T24,Ad-GFP2-T24(AdGFP1-T24和Ad-GFP2-T24分别为过表达和干扰对应载体转染T24细胞系),RT-PCR和WB验证转染效率;甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理T24细胞系,获得5-Aza-CdR-T24。3、WB检测Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh1-T24,Ad-GFP2-T24,5-Aza-CdR-T24,T24共6种细胞株凋亡相关蛋白(caspase-3,bcl-2,bax)、EMT标记物(E-cadherin,β-catenin,Vimentin)、细胞周期相关蛋白(p27,cyclinD1,cyclinE1,CDK2)的表达情况。4、MTT法测定Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh1-T24,Ad-GFP2-T24,5-Aza-Cd R-T24,T24共6种细胞株细胞增殖能力;Transwell体外侵袭实验检测上述6种细胞株细胞侵袭能力;流式细胞仪检测上述6种细胞株细胞周期变化。结果:1、20例正常膀胱黏膜组织中均未检测到CADM1基因甲基化,84例膀胱尿路上皮癌组织中43例检测到CADM1启动子区甲基化,甲基化率为51.2%(43/84),两组相比差异有统计学意义(P0.01);膀胱癌组织中CADM1基因启动子区CpG岛甲基化状态与患者的年龄、性别、肿瘤数目无关(P0.05),而与肿瘤直径、肿瘤是否复发、病理分级和临床分期有关,差异有统计学意义(P0.05)。膀胱癌组织中cadm1蛋白表达(0.2613±0.1405)较正常组织(0.6957±0.0924)显著下降,差异有统计学意义(p0.01)。膀胱癌组织中发生cadm1基因启动子cpg岛甲基化其蛋白表达量明显低于膀胱癌组织中未发生cadm1基因启动子cpg岛甲基化其蛋白表达量,差异有统计学意义(p0.01)。2、成功构建cadm1过表达慢病毒载体phblv-ires-cadm1-zsgreen-pgk-puro、干扰慢病毒载体phblv-u6-shrnacadm1-zsgreen-puro及对应空载体,并分别感染人膀胱癌t24细胞系,rt-pcr和wb结果显示ad-cadm1-t24细胞cadm1mrna和蛋白表达量较ad-gfp1-t24和t24明显上升;ad-shrna1-t24细胞cadm1mrna和蛋白表达量较ad-shrna2/3-t24,ad-gfp2-t24和t24明显下调。成功获得稳定过表达和下调cadm1的t24细胞株。3、wb结果显示,ad-cadm1-t24和5-aza-cdr-t24与ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24及t24相比,凋亡相关蛋白caspase-3,bax表达量升高,bcl-2表达量降低,bcl-2/bax比值降低,促进肿瘤细胞凋亡;细胞周期相关蛋白p27表达量显著上调,cyclind1,cdk2,cycline1表达量显著下调;emt相关蛋白e-cadherin,β-catenin表达量显著上调,vimentin表达量显著下调,上调cadm1表达可抑制膀胱癌t24细胞上皮-间质转化。4、mtt检测结果显示,ad-gfp1-t24,ad-gfp2-t24及t24细胞的增殖能力未出现明显差别,而ad-cadm1-t24和5-aza-cdr-t24细胞的增殖能力明显降低,ad-sh1-t24细胞的增殖能力明显提高,ad-cadm1-t24与ad-gfp1-t24和t24、5-aza-cdr-t24与t24、ad-sh1-t24与ad-gfp2-t24和t24相比差异均有统计学意义(p0.05)。体外transwell侵袭实验检测结果显示,ad-cadm1-t24,ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24,5-aza-cdr-t24,t24细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为(29.54±7.66),(65.57±10.02),(75.61±12.53),(61.32±15.43),(35.36±8.53)和(59.54±14.58);统计结果显示,ad-cadm1-t24与ad-gfp1-t24和t24、5-aza-cdr-t24与t24、ad-sh1-t24与ad-gfp2-t24和t24相比差异均有统计学意义(p0.05)。流式细胞仪测定细胞周期结果显示,ad-cadm1-t24,ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24,5-aza-cdr-t24,t24细胞g0-g1期细胞比例(%)分别为(62.11±1.73),(40.73±1.83),(37.14±3.14),(41.50±2.75),(54.10±7.32),(42.93±5.00);s期细胞比例分别为(17.39±3.12),(35.74±2.41),(43.94±3.17),(34.74±2.87),(23.98±7.39),(34.66±3.64);Ad-CADM1-T24与Ad-GFP1-T24和T24、5-Aza-CdR-T24与T24、Ad-sh1-T24与Ad-GFP2-T24和T24相比差异均有统计学意义(P0.05)。结论:1、膀胱尿路上皮癌中,CADM1基因启动子区CpG岛甲基化可能是导致其蛋白表达下调的主要原因之一;CADM1基因启动子区CpG岛甲基化与膀胱癌的发生、发展相关。2、上调CADM1表达可明显降低人膀胱癌T24细胞的增殖、侵袭能力,并可促进肿瘤细胞的凋亡。3、CADM1发挥抑癌作用的机制可能与抑制细胞上皮-间质转化、调控和细胞周期、凋亡、增殖等相关蛋白的表达有关。4、甲基化抑制剂5-Aza-Cd R可逆转CADM1基因启动子区CpG岛甲基化状态,从而诱导其重新表达。
【关键词】：膀胱癌 细胞粘附分子1 肿瘤侵袭转移 上皮-间质转化 细胞凋亡甲基化 5-氮杂-2-脱氧胞苷
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 缩略语/符号说明13-15
• 前言15-17
• 研究现状、成果15-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、膀胱癌组织中CADM1启动子甲基化状态和蛋白表达及其临床意义17-27
• 1.1 对象和方法17-22
• 1.1.1 组织标本17
• 1.1.2 主要试剂17-18
• 1.1.3 主要仪器18
• 1.1.4 MSP检测CADM1基因启动子CpG岛甲基化状态18-20
• 1.1.5 WB检测CADM1基因蛋白表达情况20-22
• 1.1.6 统计分析22
• 1.2 结果22-24
• 1.2.1 CADM1基因甲基化状态及其与临床病理特征的关系22
• 1.2.2 CADM1蛋白表达情况及其甲基化与蛋白表达量的关系22-24
• 1.3 讨论24-26
• 1.3.1 CADM1简介及功能概述24-25
• 1.3.2 CADM1基因启动子甲基化状态和蛋白表达25-26
• 1.4 小结26-27
• 二、构建CADM1过表达和干扰T24细胞系27-52
• 2.1 对象和方法27-37
• 2.1.1 实验对象27
• 2.1.2 主要试剂27
• 2.1.3 主要仪器27-28
• 2.1.4 细胞复苏28
• 2.1.5 细胞常规培养28
• 2.1.6 细胞传代28-29
• 2.1.7 细胞冻存29
• 2.1.8 CADM1过表达慢病毒载体构建并稳转T24细胞系29-34
• 2.1.9 CADM1干扰慢病毒载体构建并稳转T24细胞系34-37
• 2.1.10 WB检测 5-Aza-Cd R-T24细胞CADM1表达37
• 2.1.11 统计分析37
• 2.2 结果37-47
• 2.2.1 稳定表达CADM1的T24构建及鉴定37-42
• 2.2.2 稳定干扰CADM1的T24构建及鉴定42-46
• 2.2.3 WB检测 5-Aza-Cd R-T24细胞CADM1表达表达情况46-47
• 2.3 讨论47-50
• 2.3.1 关于慢病毒载体47-50
• 2.3.2 关于 5-Aza-Cd R50
• 2.4 小结50-52
• 三、CADM1过表达和干扰T24细胞功能变化52-65
• 3.1 对象和方法52-54
• 3.1.1 研究对象52
• 3.1.2 主要试剂52
• 3.1.3 主要仪器52
• 3.1.4 细胞培养和传代52
• 3.1.5 蛋白测定52
• 3.1.6 细胞增殖测定52-53
• 3.1.7 体外侵袭实验53
• 3.1.8 流式细胞仪测定细胞周期53-54
• 3.1.9 统计分析54
• 3.2 结果54-61
• 3.2.1 WB测定相关蛋白表达54
• 3.2.2 MTT法检测细胞增殖54
• 3.2.3 体外侵袭实验54-58
• 3.2.4 CADM1对细胞周期的影响58-61
• 3.3 讨论61-64
• 3.4 小结64-65
• 结论65-66
• 参考文献66-71
• 发表论文和参加科研情况说明71-72
• 附录72-75
• 综述75-88
• 参考文献83-88
• 致谢88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 ;Lentivirus-mediated RNA Interference and Over-expression of CDK2AP1 CDNA Regulate CDK2AP1 Expression in Human Lung Cancer A549 Cells[J];Chemical Research in Chinese Universities;2011年03期

2 武立伟;刘晓强;张霖;罗艺;王一;孙光;;肺癌肿瘤抑制因子1在膀胱尿路上皮癌中的表达[J];现代泌尿生殖肿瘤杂志;2009年05期

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本文编号：547848