MiR-181a-5p靶向抑制Egr1延缓糖尿病肾病肾间质纤维化

发布时间：2018-01-27 15:25

  本文关键词： microRNA-181a-5p Egr1 HK-2细胞 肾小管间质纤维化 糖尿病肾病　出处：《南方医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的和意义肾小管间质纤维化(Tubulointerstitialfibrosis,TIF)在糖尿病肾病(Diabeteic nephropathy,DN)肾纤维化过程中扮演着十分重要的角色。研究发现早期生长反应因子1(early growth response factor 1,Egr1)在DN肾纤维化过程中发挥重要的作用,但潜在机制不明确,并且尚不明确Egr1在DN中是否调控TIF。微小RNA(microRNA,miRNA)作为一种转录后水平的调节因子,通过与靶基因的3'端非翻译区(untranslatedregion,UTR)的直接结合抑制靶基因的表达。研究证实在DN肾纤维化过程中,多种miRNA均发挥着十分重要的作用。但何种miRNA可以靶向调节Egr1的表达调控TIF尚不明确。本课题开展了体内体外实验两部分。旨在探讨:1、在DN肾纤维化过程中,Egr1对TIF是否发挥作用。2、锁定Egr1的上游调控因子miR-181a-5p。3、验证miR-181a-5p是否靶向抑制Egr1的表达延缓TIF。希望通过本研究为深入理解DN的发病机制和寻找新的治疗靶点奠定理论基础。研究方法1、选取雄性OLETF大鼠构建DN动物模型,LETO大鼠为对照组,PAS染色和Masson染色检测40周龄大鼠肾脏的病理变化。免疫组化检测大鼠肾组COL I mRNA和蛋白的表达。2、HK-2 细胞分别转染质粒 pENTER-Egr1 或 siEgr1,qRT-PCR 和 Western blot检测Egr1、TGF-β1、FN和COL I mRNA和蛋白的表达。3、高糖及高渗培养液孵育HK-2细胞,qRT-PCR和Western blot检测Egr1 mRNA和蛋白的表达。4、生物信息学网站筛选靶向调节Egr1的miRNA。高糖培养基孵育HK-2细胞,qRT-PCR检测筛选出的miRNA,锁定miR-181a-5p。qRT-PCR检测大鼠肾组织miR-181a-5p mRNA。双荧光素酶报告基因验证miR-181a-5p对Egr1的靶向调控作用。5、HK-2 细胞分别转染 miR-181a-5p mimics 或inhibitor,qRT-PCR和 Western blot检测Egr1、TGF-β1、FN和COL I mRNA和蛋白的表达。6、HK-2 细胞分别转染 siEgr1、miR-181a-5p inhibitor 或 siEgr1+ miR-181a-5p inhibitor,qRT-PCR 和 Western blot 检测 Egr1、TGF-p1、FN 和 COL I mRNA 和蛋白的表达。结果1、40周龄的OLETF大鼠肾组织已经呈现DN肾纤维化的病理特征,并且Egr1和TGF-β1表达明显上调,Egr1、TGF-β1、FN和COLImRNA及蛋白的表达均明显增加。2、HK-2 细胞中,过表达 Egr1 使 Egr1、TGF-β1、FN 和 COLImRNA 及蛋白表达均明显上调;沉默Egr1使Egr1、TGF-β1、FN和COL I mRNA及蛋白的表达均明显下调。3、HK-2细胞中,高糖孵育使Egr1 mRNA及蛋白表达均呈现时间依赖性变化的特点。高渗孵育使Egr1基因表达无明显变化。4、生物信息学预测初步锁定了 9个miRNAs。HK-2细胞中,高糖孵育使miR-181a-5p mRNA表达呈时间依赖性变化,且与Egr1 mRNA表达呈负相关;高渗孵育使miR-181a-5p mRNA表达无明显变化。40周OLETF大鼠肾组织中miR-181a-5p mRNA表达明显下降。双荧光素酶报告基因显示miR-181a-5p与Egr1 3'UTR靶向结合。5、HK-2 细胞中,过表达 miR-181a-5p 使 Egr1、TGF-β1、FN 和 COL Ⅰ mRNA及蛋白表达均明显下调;沉默miR-181a-5p使Egr1、TGF-β1、FN和COL Ⅰ mRNA及蛋白表达均明显上调。6、HK-2 细胞中,共转染 siEgr1+miR-181a-5p inhibitor 可以回复沉默 Egr1基因表达引起的Egr1、TGF-β1、FN和COL Ⅰ mRNA及蛋白表达下调。结论1、40周龄的OLETF大鼠肾组织呈现DN肾纤维化的病理特点。2、HK-2细胞中,Egr1通过上调TGF-β1增加ECM的合成。3、miR-181a-5p与Egr1 3'UTR靶向结合调控Egr1的表达。4、HK-2细胞中,miR-181a-5p通过抑制Egr1调控TGF-β1介导的纤维化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R692.9

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