XCT790对缺氧、无血清及高糖诱导MSCs凋亡的影响

发布时间：2018-01-30 15:56

本文关键词： XCT790 骨髓间充质干细胞雌激素相关受体α 凋亡　出处：《第三军医大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的糖尿病患者中,有15%发生糖尿病足部溃疡(Diabetic foot ulcers,DFUs),其危害大,常规治疗疗效不佳,世界各国医学专家都在积极寻找到新的方法治疗糖尿病周围血管病变。近年来,自体干细胞移植疗法治疗缺血性疾病的疗法逐渐得到肯定和重视。其中,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源丰富,体外扩增安全性好,成为治疗糖尿病下肢缺血的最佳选择之一。但是,由于缺氧、缺营养、炎症等因素的影响,干细胞移植后大量凋亡,成为制约其疗效的关键问题。本课题组前期研究表明,过氧化物酶体增殖体激活受体γ辅活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)能激活MSCs的Bcl-2抗凋亡途径,使MSCs耐受凋亡。但Bcl-2蛋白上游的调控机制还不甚清楚,有待进一步研究。雌激素相关受体α(estrogen-related receptorα,ERRα)是世界上最早被发现的孤儿核受体之一,对能量代谢的活化起着重要作用,但鲜有文章研究ERRα在细胞凋亡途径中的作用。课题组根据前期的研究和工作推测,PGC-1α有可能通过过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)和/或ERRα这两种核受体来实现,因此本文选择ERRα为突破口研究其与MSCs凋亡以及Bcl-2基因表达的联系。我们利用ERRα的特异性拮抗剂XCT790拮抗ERRα,观察MSCs在缺氧、缺营养、高葡萄糖条件下耐受凋亡能力是否下降,验证ERRα与MSCs的凋亡是否相关。实验方法与结果1.购买57BL/6小鼠骨髓间质干细胞株,用诱导培养基诱导其分化为成脂和成骨细胞,油红O染色和茜素红染色结果为阳性。流式细胞仪检测MSCs表面抗原标记,Sca-1、CD44呈阳性,CD34、CD45为阴性。2.MSCs正常培养条件预实验分为5组:1个空白对照组、4个不同浓度XCT790组(培养基中分别加入0.25%DMSO+0、5、10、20μmol/L XCT790),每组设3个复孔。都采用含10%FBS的DMEM/F12完全培养基培养,培养24 h上流式细胞仪检测凋亡率。结果显示各组间凋亡率无显著差异(P0.05)。3.MSCs凋亡诱导实验的分为5组:1个正常培养对照组,在0.25%DMSO+10%FBS、正常氧分压条件下培养;4个不同浓度XCT790干预组(培养基中分别加入0.25%DMSO+0、5、10、20μmol/L XCT790)用3%O2、无FBS、葡萄糖浓度25 mmol/L的培养条件诱导MSCs凋亡,在12和24 h时检测凋亡率。24 h时0、5、10及20μmol/L XCT790干预组凋亡率为24.60%±1.37%,32.73%±3.01%,42.64%±4.46%and61.35%±6.78%,5~20μmol/L干预组显著高于0μmol/L干预组,且在5~20μmol/L内呈剂量依赖性(P0.05,P0.01)。4.在MSCs诱导凋亡24h时,Real-Time PCR检测Bcl-2、Bax基因和蛋白表达水平,5~20μmol/L XCT790干预组的Bcl-2 mRNA表达和Bcl-2/Bax比值显著低于0μmol/L干预组(P0.05),且Bcl-2/Bax比值呈剂量依赖性(P0.05)。在24 h时检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平,5~20μmol/L XCT790干预组的Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax比值显著低于0μmol/L干预组(P0.05),而Bax蛋白表达显著高于0μmol/L干预组(P0.05),Bcl-2/Bax比值呈剂量依赖性(P0.05)。结论1.本实验采用的MSCs具有成骨、成脂分化的能力,表达Sca-1和CD44表面标记,不表达造血干细胞标记CD34、CD45,符合小鼠MSCs的鉴定特征。2.正常培养条件下加入不同浓度XCT790,24 h内MSCs凋亡率没有明显变化,提示在没有诱导凋亡的因素存在时,拮抗ERRα并不导致MSCs凋亡。3.缺氧、缺营养及高糖条件下,拮抗ERRα可使MSCs凋亡率明显升高,Bax蛋白表达增加,而Bcl-2基因和蛋白表达明显下降,Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值明显下降,提示ERRα可能通过Bcl-2蛋白途径发挥抗凋亡作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2

【参考文献】