长链非编码RNA在百草枯致小鼠肺纤维化模型中的表达谱分析及作用初步研究

发布时间：2018-01-31 08:56

  本文关键词： 百草枯 肺纤维化 长链非编码RNA uc.77 2700086A05Rik A549　出处：《南京医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的:1.选择BALB/c小鼠,制造百草枯致肺纤维化疾病模型,以进一步行实验研究。2.筛查lncRNA在纤维化肺组织中表达谱,筛选出与肺纤维化相关的lncRNA.3.研究lncRNA在肺纤维化中的作用,以为临床研究及治疗百草枯所致肺纤维化提供生物靶点。研究方法:(一)动物造模1.应用腹腔注射百草枯,制造百草枯中毒小鼠模型,根据病理切片及相关分析,建立肺纤维化小鼠模型。2.实验分组:本实验分为2组:正常对照组、百草枯造模组。3.小鼠肺纤维化模型的建立:以10mg/kg剂量,腹腔注射百草枯药液,第一次记为Day 0,连续注射5次,每3日一次。在最后一次注射后6小时处死小鼠,取出标本,以HE染色评价基本病理变化,以Masson染色评估纤维化情况,免疫组化法检测纤维化特异性基因α-SMA表达,荧光定量PCR检测纤维化特异性基因表达。(二)芯片实验1.随机抽取3对小鼠肺组织,送上海康成生物有限公司,行lncRNA芯片分析。2.检测纤维化肺组织及正常肺组织中差异表达的lncRNA:根据芯片提供结果,从众多lncRNA中筛选出差异表达的lncRNA。3.小鼠肺组织中验证芯片结果中差异表达:数据库中搜索得出lncRNA序列,根据lncRNA序列设计相应引物,采用荧光实时定量PCR方法,检测芯片结果中差异表达的lncRNA在肺组织中表达情况。4.数据库预测靶基因在纤维化肺组织中的验证:根据所选研究的lncRNA uc.77及2700086A05Rik,针对性地研究该lncRNA的预测靶基因ZEB2及HOXA3,采用荧光实时定量PCR方法,检测纤维化肺组织中上述靶基因mRNA表达情况。(三)过表达实验1.根据所选lncRNA,提交序列至上海吉玛制药技术有限公司,以PEX-3质粒为载体,合成uc.77及2700086A05Rik过表达质粒。实验完成后交付测序报告、对比图谱、过表达质粒。2.常规培养人肺腺癌细胞(A549),以A549细胞作为研究对象,转染过表达质粒后,观察细胞形态学变化,荧光实时定量PCR验证过表达效率。3.过表达lncRNA后,采用荧光实时定量PCR方法,检测预测靶基因ZEB2及HOXA3 mRNA表达变化。4.过表达uc.77及2700086A05Rik后,检测A549细胞功能学改变情况:采用采用荧光实时定量PCR方法,检测上皮细胞标志E-钙黏蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、细胞角蛋白(KRT5),间充质细胞标志波形蛋白(Vimentin)、α-肌动蛋白(α-SMA),细胞外基质标志物MMP-2、MMP-9mRNA水平的表达变化。结果:(一)小鼠造模1.百草枯造模发病情况及体重变化:小鼠腹腔注射百草枯溶液后,小鼠活动量及进食量较前减少,呼吸急促,毛发光泽度变差,体重呈逐渐下降趋势,后期出现部分小鼠死亡。对照组小鼠正常生长,体重成正常增长趋势,造模期间无死亡。2.组织病理学改变:HE染色显示:显微镜下,百草枯模型的小鼠肺组织见大量炎性细胞浸润在肺间质中,间质增厚,对照组小鼠肺泡结构完整清晰,未见明显炎症细胞浸润现象。经Masson染色后切片中,纤维组织可被染成明显的蓝色。光镜下,百草枯组的小鼠肺组织纤维组织形成,被染成蓝色的肺间质增厚,对照组小鼠肺泡结构完整清晰,染色均匀,无明显蓝色沉积,肺泡壁厚度正常。3.免疫组织化学分析:免疫组化法检测两组小鼠肺组织中α-SMA蛋白表达情况,在正常对照组中,少见α-SMA蛋白表达,在百草枯组中,可见多量α-SMA蛋白(褐色)表达。4.纤维化相关基因表达:荧光定量PCR方法检测E-cadherin,α-SMA,COL-1,COL-3,CTGF,MMP-3,Fibronectin 表达,在造模组中 α-SMA,COL-1,COL-3,CTGF,MMP-3,Fibronectin 均表达上升,E-cadherin 表达下降。(二)lncRNA芯片结果分析:1.lncRNA差异表达分析:根据芯片结果,以差异倍数5倍且P0.05为筛选条件,筛选出显著性差异表达的lncRNA及mRNA,相对于正常肺组织,在纤维化组织中表达上调和下调超过5倍的lncRNA分别有513种和204种。2.靶基因的基因本体论分析:靶基因进行Gene Ontology分析示表达下调的lncRNA靶基因所参与的功能包括基因表达、调节凋亡、细胞分化、气体转运、高分子代谢调节、氧化应激反应、肺部发育、气道发育、呼吸系统发育、Rho蛋白转导。下调的lncRNA靶基因所参与的功能包括细胞分化、组织发育、MAPKKK级联、炎症反应、上皮细胞形态、损伤反应、MAP激酶活性调节、上皮通道形态形成、肺形态发育。3.靶基因的KEGG Pathway分析:差异表达的lncRNA靶基因所参与的通路主要包括:细胞连接分子,过氧化物、药物代谢酶细胞色素P450、哮喘、嘧啶代谢、P53信号通路、细胞缝隙连接、MAPK信号通路等。4.差异表达的lncRNA组织验证:在lncRNA基因芯片筛查肺纤维化相关lncRNA及其靶基因预测基础上,选择上调的lncRNA(AK052811,2700086A05Rik,uc.77,uc007mmq.1,uc008dzl.1,ENSMUST00000159621 and uc009ktt.l)以及下调的 lncRNA(ENSMUST00000121776,uc.455-,BC027568,ENSMUST00000065709,uc.456+,ENSMUST00000119054,and ENSMUST00000120952)作为研究对象,经荧光实时定量PCR检测,上述lncRNA均在肺组织中存在表达差异。5.预测靶基因的组织学验证:根据差异倍数5倍,对照组与纤维化组双侧本底表达量高,预测基因为明确参与肺纤维化的关键蛋白,基因组中位置相关,种属保守性高等条件,选取两个lncRNA(uc.77及2700086A05Rik)作为研究对象,采用实时定量RT-PCR方法,检测两组肺组织中,相应预测靶基因ZEB2及HOXA3表达与对照组相比,均存在表达差异。(三)lncRNA功能学分析1.过表达后细胞形态学变化:细胞形态由不规则椭圆形变为狭长形。2.过表达验证:对于转染lncRNA后的A549细胞,提取总RNA,行逆转录后,经荧光实时定量PCR检测空白对照组及转染组之间lncRNA表达水平差异,鉴定转染效率。转染lncRNA uc.77及2700086A05Rik后,其细胞内表达明显高于空白组及阴性对照组。3.转染lncRNAuc.77及2700086A05Rik后靶基因验证:根据靶基因预测结果显示uc.77靶基因为ZEB2,2700086A05Rik靶基因为HOXA3。在空白组、阴性对照组及转染组间验证ZEB2、HOXA3 mRNA表达差异,可见转染uc.77后,ZEB2基因的表达上升;转染2700086A05Rik后,HOXA3的表达下降,表达差异均存在统计学意义(P0.05)。4.转染后纤维化相关基因检测(lncRNA功能学验证):验证上皮细胞标志E-cadherin、EpCAM、KRT5;间充质细胞标志 Vimentin、α-SMA;细胞外基质标志物 MMP-2、MMP-9。在转染 uc.77 及 2700086A05Rik 后,E-cadherin、EpCAM、KRT5 表达下降,而 Vimentin、α-SMA、MMP-2、MMP-9 mRNA 表达上升。结论:1.经腹腔注射百草枯药液,可稳定有效的制造出肺纤维化小鼠模型。2.多种lncRNA参与小鼠肺纤维化过程。多种差异表达的lncRNA的靶基因参与了肺纤维化过程。经芯片检测以及实时荧光定量PCR验证,lncRNAuc.77及2700086A05Rik明显高表达在纤维化小鼠肺组织中,且预测靶基因ZEB2和HOXA3与纤维化明显。3.分别转染lncRNAuc.77及2700086A05Rik至人A549细胞后,其靶基因ZEB2及HOXA3表达明显变化,引起细胞形态改变,并促进纤维化相关基因表达变化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R595.4;R-332

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本文编号：1478740