高浓度胰岛素对体外成纤维样滑膜细胞生物学行为的影响及机制探讨
本文关键词： 成纤维样滑膜细胞 胰岛素 自噬 IL-1β 出处：《山东大学》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：背景:近年来,越来越多的研究表明糖尿病与骨关节炎之间存在相关性,关于糖尿病是否会促进骨关节炎的发生发展及其相关机制逐渐成为研究热点。成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synovial cells,FLS)作为维持关节腔内环境的重要细胞之一,亦是关节腔内炎症的主要来源之一,其正常活动的改变可引起或加重关节软骨退变。伴随人类对胰岛素抵抗认识的不断深入,高胰岛素血症逐渐受到研究者的重视。作为人体重要激素之一,胰岛素除调节能量代谢外,还对机体其他生理活动亦有重要影响。自噬是细胞维持稳态的重要生理活动,其对多种炎症或退行性疾病致病机制有着重要作用,但自噬的相关调节机制尚在不断研究中。目前尚缺乏有关高浓度胰岛素对滑膜成纤维细胞在自噬、趋化巨噬细胞的能力以及炎性反应活动等方面的生物学功能影响机制的研究。本研究可能有助于找寻糖尿病与骨关节炎之间潜在的联系机制,加深对骨关节炎发病机制的认识,进而为骨关节炎的临床管理提供新的思路。目的:体外环境下模拟高浓度胰岛素环境,研究其对FLS的增殖、趋化巨噬细胞能力、自噬以及炎性反应活动等生物学功能的影响,并探讨可能的分子机制。材料和方法:采用二步酶消法获取人原代成纤维样滑膜细胞;利用CCK-8技术检测不同浓度胰岛素处理不同时间对FLS增值能力的影响,并由此确定实验使用胰岛素浓度。利用正常培养24h后FLS上清液、高浓度胰岛素处理24h后FLS上清液以及含高浓度胰岛素的培养基培养使用Transwell方法研究高浓度胰岛素对FLS趋化巨噬细胞运动能力的影响。采用Western blotting技术检测不同时间高浓度胰岛素(1000nmol/L)对FLS的Akt通路和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的影响。使用雷帕霉素抑制mTOR,通过检测LC3蛋白的相对含量研究mTOR是否参与介导高浓度胰岛素的作用。利用重组人IL-1β(10ng/mL)诱导24h后,使用RT-qPCR技术检测其对IL-1 β、IL-6、MMP9表达的影响,确定炎症模型的建立。而后是使用Western blotting技术探究IL-1 β诱导同时加入高浓度胰岛素对FLS细胞自噬活动的影响。利用RT-qPCR技术检测IL-1β、IL-6、MMP9研究高浓度胰岛素对细胞炎性反应活动的影响。结果:通过二步酶消法可收获数量可观的成纤维样滑膜细胞。高浓度胰岛素可以刺激FLS细胞增殖,且效果呈现浓度依赖(p0.05)。当胰岛素浓度升高到某一浓度,这种刺激效果却不再增加。Transwell结果显示INS+FLS组穿膜细胞数目明显多于INS组与FLS组(p0.01)。使用胰岛素(1000nmol/L)诱导FLS培养2h、6h、24h各组pAKT相对含量与对照组相比明显增高,且呈时间依赖性,同时LC3-Ⅱ相对含量与对照组相比明显降低,差异有统计学意义(p0.05)。使用雷帕霉素可显著提高LC3-Ⅱ相对含量,同时使用雷帕霉素和高浓度胰岛素组LC3-Ⅱ相对含量较雷帕霉素组低,但较胰岛素组高(p0.05)。使用IL-1β诱导FLS炎性反应,检测发现,与对照组相比,IL-1组LC3-Ⅱ相对含量升高;与IL-1组相比,IL-1+INS组LC3-Ⅱ相对含量降低(p0.05)。RT-qPCR检测显示高浓度胰岛素可显著降低经IL-1 β诱导的FLS中IL-1 β、IL-6、MMP9相对表达水平(p0.05)。结论:胰岛素可通过AKT/mTOR通路促进成纤维样滑膜细胞增殖,增强FLS对巨噬细胞的趋化能力,亦可抑制FLS基础自噬活动。此外,高浓度胰岛素对IL-1β诱导的自噬活动、炎性活动有抑制作用。由此可以认为,高浓度胰岛素可能影响关节滑膜正常功能,同时对IL-1β诱导的滑膜炎症反应有抑制作用。该研究可能为骨关节炎合并糖尿病患者的临床阶梯式治疗提供了新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.1;R684.3
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，本文编号：1533847
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