miR-21在糖尿病肾病发病过程中的作用及其机制研究

发布时间：2018-03-21 02:35

本文选题：微小核糖核酸-21　切入点：核转录共抑制因子SnoN　出处：《贵州医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)发生发展过程中,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)可通过激活Smads信号通路诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生及肾间质细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)的过度沉积,进而造成肾组织广泛的纤维化[1]。本课题组前期实验结果发现[2-3],随DN病程的进展,可导致TGF-β1/Smads信号通路持续激活和微小核糖核酸-21(mi R-21)表达逐渐增加,两者均参与了EMT的发生以及ECM的沉积,从而促进纤维化的发生发展。同时,我们发现核转录共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein N)作为TGF-β1/Smads信号通路的重要负调控因子,在DN发生发展过程中其蛋白水平的减少,可导致TGF-β1的致纤维化效应增强[4]。而Ski与SnoN为同一家族的成员,其启动子的3’UTR存在mi R-21的靶位点,mi R-21可通过结合到SKI基因3’UTR抑制该基因的转录和翻译。但在DN发病机制中mi R-21的效应是否与SnoN有关,两者有何关联,目前未见报道。因此,本研究拟观察糖尿病(DM)大鼠肾组织及高糖条件下肾小管上皮细胞中mi R-21和SnoN蛋白及m RNA水平的表达变化及相互影响,探讨在DN发病过程中mi R-21的作用,以及与SnoN之间的关系和可能机制,从而进一步阐明DN肾纤维化的发病机制。目的:观察糖尿病(DM)大鼠肾组织及高糖条件下肾小管上皮细胞中mi R-21和SnoN蛋白及m RNA的表达变化及相互影响,探讨mi R-21在DN发病过程中作用,以及与SnoN之间的关系和可能机制。方法:1.清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)复制DM大鼠模型,并设正常对照组(NC),每组n=10,于8周(w)、16w和24w分别处死各组大鼠。生化方法检测血糖和24小时(h)尿蛋白;HE染色(hematoxylin-eosin staining)及Masson染色观察肾组织形态变化及病理变化;免疫组织化学染色和Western blot法检测各组大鼠肾组织SnoN、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)和胶原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ,ColⅢ)的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluorescent quantitative-PCR,q RT-PCR)检测mi R-21和SnoN m RNA的表达。2.NRK-52E细胞株(大鼠近端肾小管上皮细胞),采用免疫细胞化学染色检测上皮细胞标志性蛋白E-cadherin和间质细胞标志性蛋白α-SMA在NRK-52E中的表达和分布,观察细胞形态以及生长状态;分为以下两个组:予正常糖[DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS]和高糖[19.5mmol/L D-glucose+DMEM+2%FBS]环境分别培养NRK-52E细胞,每组细胞分别培养2 h、12h、24h和48h四个时间点;Western blot检测各组细胞中SnoN、TGF-β1、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E-cadherin、α-SMA的表达情况;q RT-PCR技术检测mi R-21及SnoN m RNA的表达情况。3.采用免疫荧光染色或免疫荧光双染检测E-cadherin、α-SMA在不同糖环境NRK-52E细胞的表达和分布;通过对NRK-52E细胞进行不同质粒转染,分别过表达mi R-21或抑制mi R-21作用后予正常糖或高糖培养48h;Western blot方法检测高糖环境下,增加mi R-21表达或抑制mi R-21作用后对NRK-52E细胞SnoN、E-cadherin和Col-Ⅲ蛋白表达的影响;q RT-PCR技术检测SnoN m RNA和Smad7 m RNA的表达。4.通过转染敲低NRK-52E细胞SnoN表达后予正常糖或高糖培养48h,Western blot和q RT-PCR技术检测转染效率;予人重组骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)200ng/ml加入高糖同时培养NRK-52E细胞48h;Western blot方法检测SnoN、E-cadherin、Col-Ⅲ蛋白的表达;q RT-PCR技术检测mi R-21的表达。结果:1.生化指标及肾组织形态学变化显示DM大鼠模型复制成功且并发DN;与NC组相比,DM组大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad3(Ser423/425)、α-SMA蛋白表达增加而E-cadherin蛋白表达减少(p0.05),mi R-21和SnoNm RNA表达随疾病进程呈时间依赖性增加,但SnoN蛋白表达随疾病进展呈时间依赖性减少(p0.05),相关性分析结果提示大鼠肾组织中mi R-21和SnoN蛋白的表达量呈显著负相关(r=-0.797,p0.01);2.与NG组相比,HG组肾小管上皮细胞TGF-β1、p-Smad3(Ser423/425)、α-SMA蛋白表达增加而E-cadherin蛋白表达的减少(p0.05),mi R-21表达和SnoN m RNA随高糖刺激时间延长呈时间依赖性增加,而SnoN蛋白表达则呈时间依赖性减少(p0.05),相关性分析结果提示NRK-52E细胞中mi R-21和SnoN蛋白的表达量呈显著负相关(r=-0.899,p0.01);3.NRK-52E细胞转染p HAGE-mi R-21(过表达mi R-21)后高糖培养,高糖进一步减少E-cadherin的表达而增加CollagenⅢ的表达(p0.05),且NRK-52E细胞过表达mi R-21后高糖培养,可显著减少SnoN、Smad7 m RNA及蛋白的表达(p0.05);相反,NRK-52E细胞转染mi R-21-sponge(抑制mi R-21作用)后高糖培养,可见E-cadherin的表达增加而CollagenⅢ的表达减少(p0.05);4.NRK-52E细胞转染SnoN sh RNA后高糖培养,进一步减少了E-cadherin表达而增加了CollagenⅢ的表达(p0.05),并且mi R-21的表达上调;相反,若高糖培养NRK-52E细胞的同时加入外源性细胞因子BMP-7,BMP-7可上调SnoN的表达,从而恢复E-cadherin的表达并下调CollagenⅢ的表达,同时可减少mi R-21的表达;但NRK-52E细胞转染SnoN sh RNA后予高糖和BMP-7同时培养,可见BMP-7上调SnoN表达、抗纤维化和抑制mi R-21的效应均被削弱。结论:1.DM及高糖环境下,TGF-β1通过激活肾小管上皮细胞下游的Smad3信号通路,上调mi R-21的表达;增多的mi R-21可能通过抑制SnoN m RNA的翻译,导致SnoN蛋白水平降低,使得TGF-β1/Smad3信号通路失去控制而过度活化,促进DN的发生发展。2.高糖环境下,肾小管上皮细胞过表达mi R-21可促进EMT的发生和ECM的沉积,而抑制mi R-21作用可减轻EMT的发生和ECM的沉积,mi R-21可能通过调控SnoN、Smad7的表达,发挥致纤维化效应。3.高糖环境下,增加肾小管上皮细胞SnoN的表达可抑制mi R-21的表达和纤维化病变;相反,敲低SnoN可以促进mi R-21的表达和纤维化病变。
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【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】