骨髓间充质干细胞对高糖诱导β细胞损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2018-03-24 02:11

  本文选题：间充质干细胞　切入点：自噬　出处：《中国人民解放军医学院》2015年硕士论文

【摘要】：目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)对长期高糖损伤的p细胞的保护效应及其机制。方法：体外实验,大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)在高糖(33.3 mmol/L葡萄糖)培养基中处理48小时,之后与BM-MSCs或大鼠成纤维细胞(208F)共培养12小时,再进行下列检测：(1)由细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK8)检测INS-1细胞活性;(2)膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/ Propidium iodine)染色检测细胞凋亡率;(3)放射免疫法(Ratio Immunity Assay, RIA)检测INS-1细胞的胰岛素分泌情况；(4)免疫印记法(western blotting)检测裂解的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase 3)和两种常用的自噬标记物的表达,分别为Beclinl及微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3);(5)绿色荧光蛋白标记的LC3 (green fluorescent protein labelled-LC3, GFP-LC3)质粒转染至INS-1细胞以量化自噬;(6)应用免疫荧光法及透射电镜(transmission electronic microscope, TEM)分别检测INS-1细胞形态学及超微结构的变化;(7)应用流式细胞仪检测INS-1细胞内线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)及活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成量的变化。另外,在体内实验中,我们将BM-MSCs输注到经高脂喂养及小剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的2型糖尿病大鼠中。监测大鼠血糖、胰岛素及C-肽水平的变化。通过组织学染色、免疫荧光法及透射电镜观察大鼠胰岛及β细胞的形态学及超微结构的变化。结果：长期处于高糖环境下的INS-1细胞,其细胞活性下降、细胞凋亡率增加、基础胰岛素分泌(basal insulin secretion, BIS)与葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)均受损。BM-MSCs共培养有效减轻了长期高糖造成的这些损伤,而208F细胞共培养则无明显效应。与此同时,western blotting检测发现,在与BM-MSCs共培养的INS-1细胞中,Beclinl和LC3-Ⅱ的表达明显增加。免疫荧光染色及透射电镜观察的结果也说明BM-MSCs促进了高糖环境下INS-1细胞中自噬体与自噬溶酶体的形成。但是,抑制自噬明显削弱了BM-MSCs对长期高糖损伤的β细胞的保护效应,这就意味着BM-MSCs在一定程度上是通过增强自噬改善了高糖环境下p细胞的功能与存活。而且,与仅受到高糖处理的INS-1细胞相比,BM-MSCs改善了高糖环境下INS-1细胞中线粒体的功能,具体表现为MMP的恢复及细胞内ROS水平的下降,这在很大程度上是由于自噬清除了受损的线粒体。体内实验发现,输注BM-MSCs不仅能降低2型糖尿病大鼠血糖,还促进了胰岛及β细胞的修复。更重要的是,结果显示输注BM-MSCs使2型糖尿病大鼠胰岛β细胞中溶酶体相关酶蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2, LAMP2)表达增加、自噬体及自噬溶酶体形成增多,同时伴随着β细胞凋亡减少及胰岛素颗粒数量的增加。结论：(1)与BM-MSCs共培养后可增强INS-1细胞自噬,从而保护INS-1细胞免受长期高糖引起的损伤。(2)输注BM-MSCs亦可通过调节自噬促进2型糖尿病大鼠胰岛p细胞的修复。本实验使我们对间充质干细胞的治疗机制有了新的认识,也为临床应用间充质干细胞治疗2型糖尿病提供了重要的理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1

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本文编号：1656235