HLA-DRB1共同表位在类风湿关节炎中作用机制及与强直性脊柱炎关联性的研究

发布时间：2018-04-08 19:19

本文选题：类风湿关节炎　切入点：共同表位　出处：《南方医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：研究背景和目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性滑膜炎为主要表现的自身免疫性疾病,常导致关节破坏和残疾。发病机制尚不十分明确,与遗传、环境因素及自身免疫功能紊乱等有关。其中遗传因素约起到了60%的作用,HLA-DRB1等位基因编码的五氨基酸序列QKRAA, QRRAA或RRRAA与该病关系密切,被称为共同表位(shared epitope, SE)。共同表位学说由PETER K.等于1987年提出,通常指在类风湿关节炎患者中高表达,由HLA-DRB1某些等位基因编码的一段高度保守的五氨基酸序列,这段序列位于这些DRB1等位基因编码的β链第三高变区的70-74位。共同表位存在三个同源的氨基酸序列：1、QKRAA主要由HLA-DRB1*0401等位基因编码；2、QRRAA,主要由HLA-DRB1*0404. HLA-DRB1*0101和HLA-DRB1*0405等位基因编码；3、RRRAA,由HLA-DRB1*1001等位基因编码,其中QKRAA在白种人中最常见,RRRAA在所有人群中最为罕见。多项国内外研究已表明,HLA-DRB1共同表位与类风湿关节炎的易感性及疾病严重度均具有相关性。此外,编码共同表位的HLA-DRB 1等位基因具有等位基因剂量效应,即纯合子(有2个编码共同表位的等位基因)患者往往较杂合子(有1个编码共同表位的等位基因)疾病严重度更高,同理,杂合子患者较无编码共同表位等位基因的患者疾病程度严重。然而,这些研究多基于遗传学研究,共同表位在类风湿关节炎中起到何种作用,其机制如何,目前尚不明确。除类风湿关节炎外,多项研究表明HLA-DRB1共同表位与其他疾病相关。人类疾病中,风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、I型糖尿病、银屑病关节炎、狼疮、自身免疫性肝炎以及早发性慢性淋巴性白血病相关。另外,HLA-DRB 1共同表位与犬的自发性关节炎相关。在HLA-DRB1*0401转基因小鼠中,共同表位与自发糖尿病的发病率、胶原诱导关节炎及自身免疫性脑脊髓炎的疾病严重度相关。然而,同样与HLA-DRB1有着相关性的强直性脊柱炎是否与共同表位相关,目前未见报道。因此,本研究旨在探讨HLA-DRB1共同表位在类风湿关节炎中介导的免疫反应,以及HLA-DRB1共同表位与强直性脊柱炎的关系。第一部分：HLA-DRBl共同表位在类风湿关节炎中对CD3+CD4+T淋巴细胞的作用目的观察类风湿关节炎患者CD3+CD4+T淋巴细胞对共同表位的免疫反应,探讨共同表位在类风湿关节炎中的作用和机理。方法1.采集类风湿关节炎患者外周静脉血18例,健康人外周静脉血17例。2.使用Q IAGEN DNA抽提试剂盒,从外周血中抽提DNA。3.采用SSP-PCR法对DNA样本进行HLA-DRB 1基因分型,先进行HLA-DRB1*01.HLA-DRB1*4以及HLA-DRB1*10进行低分辨分型。再对HLA-DRB1*01.HLA-DRB1*04进行高分辨分型,根据PCR条带确定基因型。4.外周血单个核细胞(PBMC)的分离收集,采用密度梯度离心法(Ficoll分离)。5.将PBMC分为五组,分别加入刺激物刺激6小时。第一组为阳性对照组,加入佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)；第二组加入HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDTYC)；第三组加入HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)；第四组加入HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDT YC)；第五组加入培养基为空白对照组。6.PBMC使用荧光染料标记表面标志CD3+和CD4+,破膜,荧光染料标记胞内细胞因子IFN-γ、IL-17,流式细胞仪检测。结果以IFN-γ、IL-17阳性反应细胞占比表示。7.数据采用均数±标准误表示,数据使用SPSS19.0统计软件进行分析,多组数据间的比较采用Kruskal-Wallis Test,两组数据间的比较采用Nemenyi Testo显著性检验P0.05,即判断为有统计学差异。结果1.基因分型结果显示：类风湿关节炎患者共同表位阳性共9例,其中基因型为HLA-DRB 1*0401的2例,HLA-DRB1*0405的7例；共同表位阴性9例。健康人共同表位阳性3例,基因型均为HLA-DRB 1*0405;共同表位阴性14例。2.类风湿关节炎患者中,HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDT YC)刺激后,HLA-DRB1*0401者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.06±0.04%, CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.16±0.16%；HLA-DRB 1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.11±0.04%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.26±0.11%；共同表位阴性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.04+0.02%, CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.20±0.07%。H LA-DRB 1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDT YC)刺激后,HLA-DRB 1*0401者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.05±0.05%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.70±0.10%；HLA-DRB 1*040 5者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.43±0.09%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.40±0.11%；共同表位阴性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.03±0.01%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.27±0.09%。HLD-DRB 1*0402肽段(KDILEDERAAVDT YC)刺激后,HLA-DRB1*0401者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.02±0.02%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.18±0.07%；HLA-DRB 1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.05±0.03%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.07±0.03%；共同表位阴性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.02±0.01%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.09±0.02%。3.健康人中,HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDTYC)刺激后,HLA-DRB 1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.02±0.02%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.10±0.05%；共同表位阴性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.07±0.03%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.10±0.04%。HLA-DRB 1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)刺激后,HLA-DRB 1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.09±0.03%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.19±0.08%；共同表位阴性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.07±0.02%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.15±0.06%。HLD-DRB 1*0402肽段(KDILEDERAAVDT YC)刺激后,HLA-DRB1*0405者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.02±0.01%,CD3+CD4+IL-17+ T淋巴细胞产生的比例为0.12±0.10%；共同表位阴性者CD3+CD4+IFN-γ+T淋巴细胞产生的比例为0.05±0.03%,CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞产生的比例为0.18±0.08%。4.类风湿关节炎患者中,共同表位阳性者CD3+CD4+T淋巴细胞经三组肽段刺激后产生INF-γ的比例有显著性差异(P=0.0150.05),基因型对应肽段刺激高于另外两组肽段刺激(P=0.0350.05和P=0.0030.05),有显著性差异。共同表位阳性患者CD3+CD4+T淋巴细胞经三组肽段刺激后产生IL-17的比例无显著性差异(P=0.0530.05)；共同表位阴性者CD3+CD4+T淋巴细胞经三组肽段刺激后产生IFN-γ和IL-17的比例无显著性差异(P=0.3540.05和P=0.3480.05)。健康人中,共同表位阳性和阴性者CD3+CD4+T淋巴细胞经三组肽段刺激后产生IFN-Y和IL-17的比例均无显著性差异(P=0.0950.05和P=0.6510.05；P=0.6230.05和P=0.9320.05)。结论1.HLA-DRB1共同表位可刺激共同表位阳性的类风湿关节炎患者CD3+CD4+T淋巴细胞产生更多的IFN-Y,导致类风湿关节炎的发生以及疾病严重程度的加重。2.在类风湿关节炎中,HLA-DRB1共同表位不能刺激CD3+CD4+T淋巴细胞产生IL-17。第二部分：]HLA-DRB1共同表位在类风湿关节炎中对CD11C+CD8-树突状细胞的作用目的观察类风湿关节炎患者C D11C+CD8-树突状细胞(DCs)对共同表位的免疫应答,探讨共同表位在类风湿关节炎中的作用和机理。方法1.收集类风湿关节炎患者外周静脉血12例。2.使用QIAGEN DNA抽提试剂盒,从外周血中抽提DNA。3.采用SSP-PCR法对DNA样本进行HLA-DRB1基因分型,先进行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*4以及HLA-DRB1*10进行低分辨分型。再对HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04进行高分辨分型,根据PCR条带确定基因型。4.外周血单个核细胞(PBMC)的分离收集,采用密度梯度离心法(Ficoll分离)。5.采用贴壁法培养树突状细胞(DCs),分别于第1、3、5天加入GM-CSF、IL-4,第6天收集DCs。6.荧光染料标记DCs表面标志CD11c、CD83,流式细胞仪检测。7.将DCs分为五组,分别加入刺激物刺激6小时。第一组为阳性对照组,加入TNF-α：第二组加入HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDTYC)；第三组加入HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)；第四组加入HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC);第五组加入培养基为空白对照组。8.荧光染料标记DCs,选择CD11c+CD8-细胞,破膜,荧光染料标记胞内细胞因子IL-6,流式细胞仪检测。结果以IL-6阳性反应细胞占比表示。9.数据采用均数±标准误表示,使用统计软件SPSS 19.0进行分析,多组数据之间的比较采用Kruskal-Wallis Test.显著性检验P0.05,即判断为有统计学差异。结果1.基因分型结果显示：共同表位阳性6例,其中基因型为HLA-DRB1*0401的2例,HLA-DRB1*0405的4例；共同表位阴性6例。2.培养至第6天的DCs表型鉴定CDllc的比例为89.74±2.80%,CD83+的比例为6.81±1.04%,结合镜下形态,为未成熟DCs。3. HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKR A AVDTYC)刺激后,HLA-DRB1*0401者CD 11 c+CD8-IL-6+DCs的比例为0%HLA-DRB1*0405者CD11c+CD8-DCs产生IL-6的比例为1.66±0.32；共同表位阴性者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例为0.83±0.46%。HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)刺激后,]HLA.DRB1*0401者CD 11 c+CD8.IL-6+DCs的比例为0.04±0.04%；HLA-DRB1*0405者 CD11c+CD8-IL-6+DCs比例为0.11±0.07%；共同表位阴性者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例为0.52±0.18%。HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC)刺激后,HLA-DRB1*0401纯合者CD11 c+CD8-IL-6+DCs的比例为0.03±0.03%；HLA-DRB1*0405纯合者 CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例为0.11±0.11%；共同表位阴性者CD11c+CD8-IL-6+DCs比例为0.26±0.17%。4.共同表位阳性和阴性者类风湿关节炎患者其CD11c+CD8-DCs经三组肽段刺激后产生IL-6的比例均无显著性差异(P=0.3040.05和P=0.3540.05)。结论在类风湿关节炎中,]HLA-DRB 1共同表位不能刺激CD11c+CD8-树突状细胞产生IL-6。第三部分：]HLA-DRB1共同表位与强直性脊柱炎的关系目的探讨HLA-DRB1共同表位与强直性脊柱炎的关联性。方法1.采集182例强直性脊柱炎患者的DNA样本。健康对照组数据采用第二军医大学长征医院风湿免疫科实验室对404名健康人的HLA-DRB1基因分型结果。2.采用SSP-PCR法对DNA样本进行HLA-DRB 1基因分型,先进行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04以及HLA-DRB1*10进行低分辨分型。再对HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04进行高分辨分型,根据PCR条带确定基因型。3.应用SPSS 19.0软件进行统计分析,采用Chi-square Test检验。显著性检验P0.05,认为有统计学差异。结果1.强直性脊柱炎患者中,共同表位阳性者37例,比例为20.33%；健康人中,共同表位阳性者91例,比例为22.52%。2.强直性脊柱炎患者与健康人比较,HLA-DRB1共同表位阳性比例无明显差异(P=0.560.05)。结论HLA-DRB 1共同表位与强直性脊柱炎无明显关联.
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.2

【共引文献】