Rictor在老年骨质疏松中的作用及其调控机制

发布时间：2018-05-10 06:26

本文选题：骨质疏松 + Rictor　；参考：《南方医科大学》2015年博士论文

【摘要】：一前言骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨质量丢失、骨组织微观结构退变致使骨脆性增加并易于发生骨折为特征的代谢性骨病。目前,我国有近1亿骨质疏松症患者,居世界首位。由于骨质疏松引起的各种脆性骨折是导致老年人病残和死亡的重要原因,骨质疏松症已经成为严重危害公众健康的社会问题。在女性绝经后,由于雌激素缺乏有一个快速的骨丢失过程,即绝经后骨质疏松。此外,男、女性均有相对缓慢、与年龄增加相伴的骨丢失,即增龄性骨丢失。60岁以后增龄性骨丢失将更加明显,并常出现临床症状,称之为老年性骨质疏松。这两者都属于原发性骨质疏松,占骨质疏松的85-90%。目前,多数研究集中在绝经后骨质疏松,对老年性骨质疏松的了解相对缺乏,发病机制也不清楚。伴随着我国步入老龄社会,老年性骨质疏松的发病率已呈现逐年升高的趋势,尤其在人口密集、老龄化明显的华南地区。深入探索增龄性骨丢失与老年性骨质疏松的发病机制,寻找有效的防治方案是目前亟待解决的关键科学问题。老年性骨质疏松症是机体自然衰退、老化过程的组成部分,其发病与衰老、雌激素缺乏、遗传、内分泌、营养、物理等因素相关,其中衰老是引起增龄性骨丢失与老年性骨质疏松的决定性因素。雌激素缺乏曾被认为是引起绝经后骨质疏松与老年性骨质疏松共同的、最主要的原因,但最近观点认为:衰老与活性氧(reactive oxygen species,ROS)是导致骨丢失与骨质疏松的直接原因;雌激素缺乏通过增加ROS与氧化应激,进而引起骨质疏松。研究发现,ROS一方面可促进破骨细胞分化与骨吸收功能,另一方面可能抑制成骨细胞及其骨形成作用,引进增龄性骨丢失。但ROS抑制骨形成,引起老年骨质疏松的的分子机制尚未完全阐明。老年性骨质疏松的主要特征表现为骨量丢失合并骨转换的减慢,并出现骨髓脂肪累积,骨髓中的脂肪细胞与松质骨的骨量成反比。研究表明,随年龄增加,骨髓基质干细胞(bone marrow stroma cell,BMSC)向脂肪细胞分化增多,向成骨细胞分化减少,成骨细胞寿命缩短,凋亡增加,从而导致骨形成不足。同时,破骨细胞的骨吸收继续维持高水平。两者共同作用,引起骨量丢失。对于老年骨质疏松发病机制,目前多数研究集中在探讨控制老年后BMSC由成骨分化转向脂肪分化的开关分子。然而,成骨细胞前体在骨表面的黏附、成骨细胞的功能及其凋亡对维持有功能的成骨细胞数量及骨形成也起关键作用。深入研究这些过程的分子机理对于阐明增龄性骨丢失与老年性骨质疏松发病机制,并为其提供防治新靶点有重要意义。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mechanistic target of Rapamycin,mTOR)是整合细胞内外各种信号调节细胞生长与代谢的中心信号分子。mTOR在细胞内与其他蛋白质形成复合物才具有活性。目前发现有两种不同的mTOR复合物:mTORC1(mTOR complex 1)和 mTORC2。mTORC1 由 mTOR、Raptor、mLST8和 PRAS40 组成。mTORC2 包括 mTOR、mLST8、Rictor、PRR5 和 mSin1,mTORC2在磷酸化并激活Akt(S473)中起关键作用,并在细胞存活、细胞骨架调节与运动中起调节作用,但其活化机制尚不清楚。有报道中Rictor可调节成骨细胞骨架重组和BMSC的成骨分化,但Rictor/mTORC2老年骨质疏松病理发生中的作用及其调控机制尚未见报道。因此,本文通过成骨细胞特异Rictor/mTOR2及自然衰老的骨质疏松小鼠与细胞模型,从分子、细胞与整体水平探讨Rictor/mTORC2在老年骨质疏松中的作用及其上下游调节机制,为增龄性骨丢失与老年性骨质疏松病理发生提供分子机制,为其治疗提供新策略与新靶点。二目的本课题主要研究了以下内容:1老年性骨质疏松中Rictor表达及活性变化,并随着年龄增长对成骨细胞的黏附能力的影响;2通过成骨细胞特异敲除Rictor,阐明成骨细胞中Rictor的生理功能及其在老年骨质疏松发生中的作用;3探讨老年骨质疏松发生中Rictor的上下游调控机制。三材料方法1年龄增长对成骨细胞的分化、贴壁能力和功能研究。由南方医科大学实验动物中心购买12只C57/B6小鼠,分为16M组(16个月)和3M组(3个月)各6只,取其股骨固定,microCT检测其骨密度,分析其股骨远端松质骨的骨参数。进行HE染色、Trap染色、骨钙素(osteocalcin OC)免疫组织化学染色检测成骨细胞,对组织切片中的脂滴、破骨细胞、和成骨细胞计数分析。另取16M组和3M组小鼠的股骨做扫描电镜。取原代16M组和3M组小鼠的原代成骨细胞培养,鉴定细胞的黏附能力、细胞的分化能力、细胞的增殖情况和凋亡检测。2 Rictor及其下游功能分子在老年成骨细胞中表达检测。裂解16M组和3M组的小鼠的头盖骨或股骨,通过用免疫印迹法做检测其下游功能分子的变化。取两组小鼠的其他脏器组织裂解液做免疫印迹检测,与骨组织做对比。3成骨细胞特异敲除Rictor的老年骨质疏松表型鉴定。用Cre-loxp系统繁殖成骨细胞特异敲除Rictor的小鼠。用PCR鉴定基因型,取2个月和6个月的敲除小鼠和对照,取材用免疫印迹法和免疫组织化学鉴定骨组织的敲除效果,microCT分析骨量。进行Trap染色、TUNEL检测和PCNA免疫组织化学染色,对组织切片中的脂滴、破骨细胞、成骨细胞、凋亡和增殖细胞数计数分析。扫描电镜观察松质骨的骨小梁表面情况和成骨细胞形态变化。4 Rictor对成骨细胞的分化、黏附与存活的影响。取原代Rictor-KO(OSX-cre阳性的Rictor-loxp纯合子基因型小鼠)和WT(OSX-cre阴性的Rictor-loxp纯合子基因型小鼠)的原代头盖骨的成骨细胞,加成骨诱导培养基诱导,检测其分化能力、细胞的增殖,检测凋亡蛋白,、细胞的黏附能力。对细胞骨架和桩蛋白(Paxillin)采用免疫荧光共定位检测,观察细胞骨架变化。并用免疫印迹检测功能蛋白的变化。5成骨细胞中miR-218对Rictor的靶向作用取16M组和3M组的C57/B6小鼠骨组织提总RNA检测Rictor的mRNA水平变化。用成骨细胞系MG63转染miR-218 inhibitor及mimics检测Rictor表达。构建miR-218质粒并转染细胞系MG63或MC3T3-E1,通过luciferase检测其与Rictor的相互作用。构建miR-218突变体进一步验证。6 miR-218在老年成骨细胞中靶向Rictor,及其对成骨细胞黏附和存活的影响细胞系MG63或MC3T3-E1转染miR-218 inhibitor及mimics后,检测细胞的黏附能力和细胞的Rictor下游功能蛋白变化。细胞系MG63或MC3T3-E1转染miR-218 mimics并过表达Rictor,检测细胞的黏附能力和凋亡蛋白变化。MG63或MC3T3-E1转染miR-218 inhibitor并siRNA干扰Rictor,检测细胞的黏附能力和凋亡蛋白变化。7活性氧抑制剂对老年骨质疏松发生中miR-218及Rictor的影响将20只6个月大的C57/B6小鼠随机分为两组,每组10只,实验组在饮用水含活性氧抑制剂乙酰半胱氨酸(NAC)2mg/ml,对照组自由饮食,处理3个月。取骨组织提取总RNA,检测miR-218及活性氧的变化,microCT检测骨量差异,对组织切片中的脂滴、破骨细胞、成骨细胞、凋亡和增殖细胞数计数分析。四结果1小鼠成骨细胞的分化、黏附能力随年龄增长下降,成骨细胞数量减少。与3M组的小鼠相比较,16M组小鼠骨小梁数量较少,BMD明显下降,随着年龄增长骨丢失严重。OCN组化染色表明成骨细胞数量减少,而HE染色16M组脂滴空泡明显增加,年龄增加细胞向成骨分化减少,成脂分化增加。Trap染色16M组的破骨细胞数量是减少的。体外实验,16M组的原代成骨细胞分化受到抑制,细胞的增殖也比较慢,凋亡蛋白cleaved-PARP表达增加,凋亡增加。扫描电镜看到16M组骨小梁变细,骨小梁表面贴壁细胞数量减少,骨基质有损伤,并且有大量细胞印迹留下。老年鼠成骨细胞数量显著减少,并且凋亡的成骨细胞增加。2 Rictor及其下游功能分子在老年成骨细胞中表达明显下调。3M组和16M组的骨组织Rictor的表达量结果表明,Rictor在16M组下调显著。但在16M组其他脏器的蛋白裂解液中未见到明显的下调趋势,表明Rictor特异性的在老年骨组织下调。并且在骨组织中其下游功能蛋白p-Akt(S473)磷酸化被抑制,Paxillin表达下降,cleaved-PARP表达量增加。3成骨细胞特异敲除Rictor促进小鼠老年骨质疏松发生。用Cre-Loxp系统构建成骨细胞特异性敲除Rictor小鼠,繁殖出OSX-cre,Rictorfl/fl(Rictor-KO)和Rictorfl/fl(WT)。表型检测表明敲除鼠虽然在2个月时与WT并没有明显的差异,但是在6个月大时有明显的骨丢失,骨小梁数量减少,骨密度降低与WT组有显著差异,出现骨质疏松表型。成骨细胞数量也急剧的减少。对成骨细胞减少原因进行分析,发现:1敲除鼠PCNA染色阳性细胞数量减少,2 TUNEL检测表明敲除鼠凋亡细胞数量增加。通过扫描电镜发现敲除组骨小梁变细,高倍镜下黏附细胞数较少,并且有大量细胞印迹留下。成骨细胞特异敲除Rictor小鼠在6个月大就出现原发性的骨质疏松表型。4 Rictor-KO小鼠的原代成骨细胞的分化受到抑制、成骨细胞黏附能力下降并且凋亡增加。体外细胞实验Rictor-KO原代细胞成骨分化,碱性磷酸酶染色表明成骨分化受到明显抑制,细胞的黏附能力也显著下降,血清饥饿时细胞凋亡增加。检测Rictor其下游与细胞存活相关的蛋白Akt(S473)磷酸化水平降低、细胞黏附能力相关的Paxillin表达水平下降,细胞的凋亡蛋白cleaved-PARP表达量反而上升。Rictor-KO小鼠骨质疏松的原因主要是成骨分化能力下降,成骨细胞的黏附能力下降,细胞的凋亡增加,导致成骨细胞数量急剧减少,骨丢失增加。Rictor-KO小鼠骨质疏松表型与老年骨质疏松的成骨细胞的减少原因一致。5 miR-218在成骨细胞中靶向Rictor,抑制Rictor蛋白质表达。在16M组的C57小鼠中Rictor的mRNA水平变化不明显,但是蛋白水平明显下降。经生物信息学分析及初步的筛选,确定miR-218可以靶向Rictor。体外验证采用细胞系MG63或MC3T3-E1,转染miR-218 inhibitor时Rictor表达升高。转染miR-218 mimics时Rictor表达下调,凋亡蛋白升高。Luciferase结果表明miR-218可以使Rictor表达下调,且相互作用明显。6 miR-218通过靶向Rictor,抑制成骨细胞黏附和存活。QPCR结果显示miR-218在老年鼠骨组织中有明显增加。体外验证,细胞系MG63或MC3T3-E1 转染miR-218 mimics,Rictor其下游功能蛋白p-Akt(S473)磷酸水平下降、Paxillin表达量降低,cleaved-PARP表达量增加。当miR-218与Rictor过表达质粒共转染时,miR-218对Rictor的下游蛋白无影响。相反的,细胞系MG63或MC3T3-E1 转染miR-218 inhibitor,Rictor下游蛋白Akt(S473)磷酸化水平、Paxillin表达量上调。miR-218 inhibitor与si-Rictor共转染,Rictor下游蛋白p-Akt(S473)磷酸化水平、Paxillin表达量下调。以上结果表明,成骨细胞中miR-218通过负调控Rictor表达,促进骨质疏松的发生。7活性氧上调miR-218的表达,引起Rictor下调与骨质疏松发生。体外实验H2O2刺激成骨细胞系MG63或MC3T3-E1使miR-218上调。在体的活性氧抑制剂NAC处理后的小鼠与对照组相比骨密度较高,并且组织切片成骨细胞数量增加,活性氧抑制剂处理组的miR-218下调显著,Rictor表达明显上调。在体与体外实验结果表明活性氧可以上调miR-218的表达,促进骨细胞的凋亡和抑制分化,最终减少成骨细胞的数量。五结论本文利用基因敲除小鼠与细胞模型,探讨了 Rictor/mTORC2信号通路在老年骨质疏松发生中的作用及其上下游调节机制,得出以下主要结论:(1)成骨细胞的黏附能力下降,凋亡增加,导致有功能的成骨细胞数量和骨形成能力下降是老年骨质疏松发生的主要细胞学机制之一。(2)老年退行性骨质疏松发生中Rictor下调与成骨细胞黏附能力下降和凋亡增加有关。(3)成骨细胞特异敲除Rictor后小鼠成骨细胞黏附能力也下降,凋亡增加,并促进老年骨质疏松发生。(4)miR-218可直接靶向并下调Rictor表达,进而抑制成骨细胞黏附、促进成骨细胞凋亡。.(5)ROS可上调成骨细胞miR-218,导致Rictor表达下调,降低成骨细胞黏附能力并促进成骨细胞凋亡,抗氧化剂NAC可逆转这些变化并延缓小鼠老年骨质疏松发生。因此,本研究不仅证实Rictor/mTORC2信号的下调是老年骨质疏松病理发生的重要机制之一,而且建立了 ROS与miR-218、Rictor/mTORC2和老年骨质疏松之间联系,阐明了 ROS通过miR-218、Rictor/mTORC2抑制成骨细胞黏附、促进成骨细胞凋亡,从而引起老年骨质疏松这一新的机制。本研究可为骨代谢调节提供了新观点,为老年骨质疏松防治提供新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R580

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