异鼠李素对糖尿病大鼠的肾脏保护及作用机制研究

发布时间：2018-06-01 13:55

  本文选题：异鼠李素 + 糖尿病　； 参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：糖尿病肾病(DN)是糖尿病微血管病变的一种,在许多西方国家是导致终末期肾脏病的首位病因,近十几年来在我国的发病率也急剧上升,成为导致肾脏替代治疗的第二位病因,严重危害人类健康的同时造成了巨大的经济负担。目前,我们对DN的发生及进展机制的研究还不深入,多认为是遗传、环境和自身免疫因素相互作用的结果,糖脂代谢紊乱、肾脏内肾素-血管紧张素(RAS)系统激活、炎症反应及氧化应激等因素在遗传背景下相互作用,引起肾小球系膜细胞增生、基底膜增厚,最终导致肾小球硬化。糖代谢紊乱是DN发病机制中最重要的首发因素,高血糖能够引起糖基化终产物(AGEs)产生增多、激活多元醇通路、增强蛋白激酶C (PKC)的活性,从而通过引起AngⅡ水平升高、血管通透性增加、多种细胞因子的表达上调及氧化应激等促进DN的发展;血流动力学变化也是DN进展中的重要促进因素,DN早期肾小球内就产生了“三高”状态,导致内皮细胞和足细胞损伤、滤过屏障受损,同时高糖及机械应力导致的肾内RAS系统激活也通过上调TGF-β等细胞因子的表达、降低胶原酶活性等机制促进肾小球硬化;炎症反应贯穿在DN的发生及进展中,游离脂肪酸和高血糖可通过PKC和活性氧簇(ROS)激活核转录因子kappa B (NF-κB),使其下游多种细胞因子如 TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TGF-β等表达上升,引起炎性细胞浸润,血管通透性改变,系膜外基质增生及肾小球硬化;DN患者体内存在显著的氧化应激,FFA、炎性细胞因子、AngⅡ和机械压力等都能诱导肾脏细胞产生过多的ROS,ROS可以损伤足细胞导致蛋白尿、诱导AngⅡ的产生、调节PKC、TGF-[β等多种细胞因子及转录因子激活,促进肾小球硬化;其他如脂代谢紊乱、遗传因素等都在DN的发生发展中发挥一定的作用。NF-κB是在B细胞核中提取到的一种特殊蛋白因子,通过调节许多细胞基因的表达在免疫炎症反应、细胞生存、应激反应中发挥着重要作用。在正常细胞中,NF-κB存在于胞浆且与IκBα结合处于失活状态,当细胞受到某些刺激信号如高糖、TNF-α等细胞因子、氧化应激及内毒素等作用时,IκBα会被降解,NF-κB得以激活入核后调控某些基因的转录表达。高糖状态下氧化应激和PKC活化介导NF-κB激活,进而引起其下游炎症因子的表达增加,在DN中起重要作用。许多研究表明抑制NF-κB的活化及IκBα的降解能够延缓DN进展。异鼠李素是植物黄酮类化合物中的一种,在自然界多种植物的花、果实和叶中都存在,尤以沙棘、银杏等含量最高。以往国内外许多研究表明异鼠李素能够通过抑制NF-κB信号传导通路发挥抗炎症、保护内皮细胞、抗肿瘤等作用,此外异鼠李素还有明显的抗氧化活性,并呈浓度依赖性效应,具有清除自由基、减轻氧化应激造成的心肌细胞损伤的作用,目前,对于异鼠李素的研究主要在抗肿瘤及心脏保护方面,肾脏疾病方面的研究很少,尚需更多的研究探讨其在肾脏病方面的应用。本研究通过高脂高热量饮食配合链脲佐菌素一次性腹腔注射制备糖尿病大鼠模型,给予不同剂量的异鼠李素干预后评估大鼠肾脏损伤指标、肾脏病理学改变、氧化应激状态及NF-κB系统和炎症因子的表达情况,同时体外培养大鼠肾小球系膜细胞,LPS诱导氧化应激及炎症状态,给予不同剂量异鼠李素共同培养后评估氧化应激及NF-κB系统和炎症因子的表达变化,观察异鼠李素对糖尿病大鼠是否具有肾脏保护作用,并探讨可能的作用机制。第一部分异鼠李素对糖尿病大鼠的肾脏保护作用[目的]评估糖尿病大鼠的肾损伤状态,观察不同剂量的异鼠李素干预对糖尿病大鼠肾脏肾损伤指标和病理学改变的影响。[方法]动物模型制备及分组健康雄性SD大鼠45只,随机分为正常对照组(NC组)10只和模型组35只,NC组给予正常饮食,模型组大鼠给予高脂饮食4周配合链脲佐菌素(30mg/kg) —次性腹腔注射制备糖尿病大鼠模型,测外周随机血糖连续三天超过16.7mmol/l的大鼠视为造模成功,成模后的大鼠随机分为糖尿病组(DM组,n=11),低剂量异鼠李素组(ISO-50组,n=11)和高剂量异鼠李素组(ISO-50组,n=10) , ISO-50组和ISO-150组分别给予异鼠李素50mg/kg/d和150mg/kg/d灌胃,12周后留取24小时尿液及肾组织待检。肾脏损伤生物学指标及病理学检查使用强生稳豪血糖仪采用葡萄糖氧化酶法测量大鼠空腹血糖,全自动生化分析仪测24小时尿白蛋白,ELISA方法检测尿骨桥蛋白和KIM-1水平,剥离双侧肾脏称重,计算肾脏肥大指数(KI),取肾皮质行肾脏病理学检查分别观察光镜和电镜下大鼠肾脏病理改变。统计方法采用SPSS 14.0软件对结果进行统计学处理,计量资料采用均值±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间比较,并进行方差齐性检验,结果显著者采用Students-Newman-Keuls(SNK)进行两两比较,以P0.05表示有统计学意义。[结果]1试验动物入组情况3只大鼠造模未成功,2只大鼠试验过程中死亡,共有40只大鼠进入实验结果分析,其中NC组、DM组、ISO-50组和ISO-150组各10只。2大鼠肾脏肥大指数比较与对照组相比,DM组、ISO-50组、ISO-150组KI明显升高(P0.05)。而DM组KI值明显高于两异鼠李素干预组,有统计学差异(P0.05)。 ISO-50组和ISO-150组KI值无明显统计学差异(P0.05)。3大鼠空腹血糖水平比较DM、ISO-50和ISO-150三组大鼠的空腹血糖较NC组明显升高(P0.05),三组间无明显差异(P0.05)。4大鼠肾损伤指标比较DM、ISO-50和ISO-150三组大鼠的24小时尿白蛋白、骨桥蛋白、KIM-1均较对照组明显升高(P0.05),ISO-50和ISO-150两组尿白蛋白、骨桥蛋白及KIM-1水平均较DM组降低,差异有统计学意义,同时ISO-150组又较ISO-50组明显下降(P0.05)。5大鼠肾组织病理学改变光镜下,对照组大鼠肾小球形态正常,结构清楚,毛细血管基底膜无明显增厚,无系膜细胞及系膜基质增生。DM组大鼠肾小球体积肥大,部分肾小囊腔明显狭窄,毛细血管基底膜均匀增厚,系膜区增宽,肾小管基底膜亦增厚,部分肾小管上皮细胞呈空泡样变。与DM组相比,ISO-50组和ISO-150组上述病理改变均明显减轻,ISO-150组改善更为明显。电镜下,对照组大鼠可见肾小球GBM结构清楚,无GBM增厚及足突融合,系膜细胞及基质无明显增生。DM组可见肾小球基底膜呈均匀弥漫增厚,足突增宽或融合,足突裂孔膜增宽。ISO-50组和ISO-150组上述改变较DM组减轻,GBM结构较清晰,足突节段融合,ISO-150组改善更为明显。第二部分异鼠李素对糖尿病大鼠氧化应激和NF-κ B信号通路的影响[目的]观察糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平、NF-κB信号通路活化状态及炎症因子的表达情况,评估不同剂量异鼠李素干预对氧化应激、NF-κB及炎症因子表达的影响,同时体外试验观察异鼠李素对LPS诱导的大鼠系膜细胞氧化应激、NF-κB激活及炎症反应状态的影响。[方法]动物模型制备及分组 同第二部分系膜细胞培养及分组体外培养肾小球系膜细胞,随机分为正常对照组(NC组),脂多糖组(LPS组),低剂量异鼠李素组(ISO-5组)和高剂量异鼠李素组(ISO-10组),ISO-5组和ISO-10组在LPS的基础上分别加用异鼠李素5μmol/l和10μmol/l共同培养72小时。氧化应激状态测定黄嘌呤氧化酶法检测肾组织匀浆及系膜细胞培养液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性,同时比色法测定丙二醛(MDA)含量以评估氧化应激状态。肾组织及系膜细胞NF-κB通路检测ELISA方法检测肾组织匀浆及系膜细胞裂解液中NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、IκBα、磷酸化IκBα水平及NF-κB p65 DNA结合活性,RT-PCR法检测NF-κB p65mRNA 表达。肾组织及系膜细胞炎症因子检测ELISA 及 RT-PCR 法检测炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1 和 TGF-β1的蛋白和mRNA表达。统计方法采用SPSS 14.0软件对结果进行统计学处理,计量资料采用均值±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间比较,并进行方差齐性检验,结果显著者采用Students-Newman-Keuls(SNK)进行两两比较,以P0.05表示有统计学意义。[结果]1异鼠李素对氧化应激指标的影响1.1大鼠肾组织T-SOD活力及MDA水平比较DM组肾组织T-SOD活力较NC组显著下降(P0.05),而MDA水平明显升高(P0.05),ISO-50组和ISO-150组大鼠的T-SOD活力较DM组均明显升高(P0.05),MDA水平显著升高(P0.05),与ISO-50组比较ISO-150组大鼠肾组织及系膜细胞中的T-SOD活力升高,同时MDA水平下降,差异有统计学意义(P0.05)。1.2系膜细胞T-SOD活力及MDA水平比较LPS组系膜细胞T-SOD活力较NC组显著下降(P0.05),而MDA水平明显升高(P0.05),ISO-5组和ISO-10组系膜细胞的T-SOD活力较DM组均明显升高(P0.05),MDA水平下降(P0.05),与ISO-5组比较ISO-10组系膜细胞中的T-SOD活力升高,同时MDA水平下降,差异均有统计学意义(P0.05)。2异鼠李素对NF-κB信号通路激活水平影响2.1糖尿病大鼠NF-κB信号通路激活水平的比较DM组大鼠的NF-κB p65 (蛋白和mRNA)、磷酸化NF-κB p65和磷酸化IκBα均较NC组显著升高(P0.05),与DM组相比,ISO-50和ISO-150组的NF-κB p65 (蛋白和mRNA)、磷酸化NF-κB p65和磷酸化IκBα水平均有明显下降(P0.05),且ISO-150组较ISO-50组又有显著下降(P0.05),各组大鼠肾组织IκBα水平无明显差异(P0.05)。2.2系膜细胞NF-κB信号通路激活水平的比较LPS组系膜细胞裂解液中NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65及磷酸化IκBα较NC 组均显著升高(P0.05),ISO-5 和 ISO-10 组的 NF-κB p65 (蛋白和 mRNA)、磷酸化NF-κB p65及磷酸化IκBα水平较LPS组均有明显下降(P0.05),且ISO-10组较ISO-5组上述指标又有显著下降(P0.05),各组系膜细胞IκBα水平均无明显差异(P0.05)。2.3大鼠肾组织及系膜细胞NF-κB p65 DNA结合活性比较体内试验中,DM组大鼠肾组织NF-κB p65 DNA结合活性较NC组明显升高(P0.05),ISO-50和ISO-150组的NF-κB p65 DNA结合活性较DM组显著下降(P0.05),且ISO-150组较ISO-50组又有显著下降(P0.05);体外试验中,LPS组系膜细胞NF-κB p65 DNA结合活性较NC组明显升高,异鼠李素同样剂量依赖性降低了系膜细胞NF-κB p65的DNA结合活性。2.4大鼠肾组织炎症因子水平比较DM组大鼠肾组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白及mRNA水平均较NC组明显升高(P0.05),ISO-50和ISO-150组大鼠的各项炎症因子蛋白及mRNA水平较DM组显著降低,而ISO-150较ISO-50组又有明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。2.5系膜细胞炎症因子水平比较LPS组系膜细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白及mRNA水平均较NC组明显升高(P0.05),而与LPS组比较,ISO-5和ISO-10组系膜细胞中各项炎症因子的蛋白及mRNA水平均显著下降,且ISO-10组比ISO-5下降更明显(P0.05)。[结论]1异鼠李素能够降低糖尿病大鼠肾脏肥大指数,减少尿白蛋白排泄,减轻肾损伤指标,并改善大鼠肾脏病理组织学改变,延缓DN进展。2异鼠李素能够剂量依赖性改善糖尿病大鼠肾脏氧化应激状态,能显著减轻LPS诱导的系膜细胞氧化应激状态,效果呈剂量依赖性。3糖尿病大鼠肾脏存在NF-κB系统的过度活化及炎症因子表达增加;LPS能够诱导大鼠系膜细胞NF-κB系统的过度激活及炎症因子的表达水平增加,模拟炎症状态。4异鼠李素能够剂量依赖性抑制糖尿病大鼠肾组织中NF-κB系统的过度活化,降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白和mRNA水平;能够剂量依赖性抑制LPS诱导的大鼠系膜细胞NF-κB系统的过度活化,降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白和mRNA水平。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R692.9

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