类风湿关节炎患者关节液免疫复合物对成纤维样滑膜细胞功能影响的研究

发布时间：2018-06-03 07:57

本文选题：类风湿关节炎(rheumatoid + arthritis　；参考：《南方医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：研究背景：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以对称性、破坏性的慢性关节滑膜炎症为主要病理变化的自身免疫性疾病。尽管RA发病机制尚不明确,但研究表明自身免疫反应在RA滑膜炎病理过程中发挥重要作用。近年来发现,在RA患者血液、关节滑膜(液)和软骨组织表层存在多种自身抗原、抗瓜氨酸化蛋白自身抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,ACPA)及免疫复合物(immune complex,IC)。目前已发现多种瓜氨酸化蛋白为ACPA的靶抗原,如波形蛋白(Vim)、纤维蛋白(原)、Ⅱ型胶原、聚丝蛋白、α-烯醇酶和角蛋白等,这些蛋白均以瓜氨酸化形式存在于RA炎性关节内。IC通过与补体成分、细胞Fc受体和补体受体结合诱导促炎症性细胞因子的产生,是RA炎症反应导致关节骨和软骨组织损伤和关节畸变的最主要机制。骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨变性破坏及骨质增生为特征的慢性关节疾病,因其易累及膝关节,形成膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis, KOA),与RA具有相似的临床症状,故两者的鉴别诊断十分必要。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)是构成关节滑膜组织的主要细胞成分。RA滑膜炎症中存在着复杂的FLS-巨噬细胞-淋巴细胞间相互作用网络。目前认为,虽然RA患者关节滑膜内大量炎性细胞浸润,但真正导致滑膜增生的原因是FLSs的过度增殖与活化。RA滑膜组织内FLSs不仅大量增生,还以自分泌和旁分泌的方式来分泌或应答多种炎性介质如细胞因子(cytokine, CKs)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等效应分子,对单核巨噬细胞、T细胞、B细胞、基质细胞和骨及软骨细胞发挥多效性作用(pleiotropic effects),参与RA滑膜增生和软骨及骨质破坏过程。因此,研究滑膜细胞的功能对进一步探讨RA的发病机制及体外筛选抗类风湿药物具有重要意义。迄今为止,有关IC对RA滑膜免疫活性细胞功能影响的研究仅局限在单核巨噬细胞和软骨细胞等。然而,有关IC特别是ACPA特异性IC (ACPA-IC)对RA患者FLS增殖、分泌炎性介质(CKs、MMPs)等功能影响的研究尚未见报道。鉴于关节滑膜液(synovial fluid,SF)是RA免疫炎性损害的重要靶位,而ACPA、IC和FLSs均为RA重要的效应分子和细胞,对SF中IC进行深入研究,更能直接反映滑膜组织局部IC和FLSs参与滑膜炎性损伤的作用。根据前期实验研究,我们提出如下假设,RA患者关节滑膜局部炎症反应引起相关自身抗原的瓜氨酸化,导致ACPA产生,后者与瓜氨酸化蛋白结合形成ACPA-IC。RA患者关节SF中存在含多种瓜氨酸化抗原的ACPA-IC,ACPA-IC与滑膜FLSs结合,诱导细胞核内相关基因表达,激活相应信号通路,使信号分子活性增高,促进其下游促炎性CKs和MMPs等炎性介质的分泌,这些炎性介质又能反过来作用于滑膜组织(synovial tissue,ST)中各种免疫活性细胞,增强局部炎症反应,导致更多Cit-P的产生,形成恶性循环,进而导致更严重的骨和软骨破坏。肽酰基精氨酸脱亚氨酶(peptidylarginine deiminase,PADI)是一种翻译后修饰酶,它能够将蛋白质内的精氨酸残基转化为瓜氨酸残基,瓜氨酸化蛋白的形成与ACPA的产生和RA的发生发展有着密切的关系。瓜氨酸是一种非标准氨基酸,它不参与翻译过程中的蛋白合成过程,而是由PADI酶在Ca2+存在条件下翻译后修饰生成的。有人认为瓜氨酸化和精氨酸残基甲基化是同时存在的竞争过程,PADI酶可以通过将甲基化精氨酸转换成瓜氨酸而逆转氨基酸残基的甲基化。在哺乳动物中,PADI酶家族主要分为五种同工酶,即PADI1、PADI2、PADI3 PADI4和PADI6。而每种PADI酶都有其典型的细胞定位、组织分布和特异底物。PADI1主要表达在皮肤组织,它可将丝聚合蛋白和角蛋白瓜氨酸化,有助于皮肤的角化。PADI2是PADI酶中分布最广的,它在中枢神经系统、脾脏、分泌腺和骨骼肌组织中均高水平表达,其底物蛋白主要包括大脑和脊髓的髓磷脂碱性蛋白和凋亡单核细胞及巨噬细胞中的波形蛋白。PADI3仅在毛囊表达,对毛发的定向生长起着重要作用。而PADI4在白细胞中高表达。细胞核中,它主要介导核仁磷酸蛋白和组蛋白的瓜氨酸化。最近发现,PADI6在卵巢和睾丸组织高水平表达,但是它的功能和酶活性尚不明确。其中PADI2和PADI4与RA关系最为密切。目的：1.取RA和OA患者关节液中提取的抗瓜氨酸化肽特异性免疫复合物(anti-citrullinated peptide antibody specific immune complexes,ACPA-ICs),在不同IC浓度梯度下,分别对RA患者关节FLSs进行刺激,以探讨ACPA-IC对FLSs增殖功能的影响。2.取RA和OA患者关节液中提取的ACPA-IC,在不同IC浓度梯度下,分别对RA患者关节FLSs进行刺激,用ELISA法检测细胞上清中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3的含量,以探讨ACPA-IC对FLSs CKs和MMPs分泌功能的影响。3.分别从RA和OA患者关节滑膜组织(synovial tissue,ST)提取蛋白,并对两组蛋白进行鉴定。4.将从RA和OA患者ST中提取的蛋白进行western blot检测,以分析RA和OA患者ST中PADI4的表达量是否存在差异。同时,对RA患者血清抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、抗链球菌溶血素O(anti-streptolysin,ASO)和RF等相关实验指标进行检测,以期研究滑膜组织中PADI4的表达量与临床相关实验指标是否具有相关性。进一步探讨PADI4在RA中的致病作用。方法：1.采用G蛋白免疫亲和层析法,从RA患者和OA患者关节液中提取IC,BCA法检测提取后各组ICs蛋白质浓度；CLIA法检测提取后及混合前后各组IC中ACPA的浓度。2.无菌条件下获取手术切除的RA患者关节滑膜组织,分离纯化FLSs,并进行体外培养,取第4～7代细胞进行实验刺激。3.用纯化后的各组IC刺激RA FLSs,CCK-8法检测刺激后FLSs的增殖情况。4.用ELISA法分析IC刺激RA FLSs后细胞培养液上清中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3的分泌情况。5.无菌条件下获取手术切除的RA和OA患者的关节ST,液氮研磨提取蛋白,western blot法检测ST中PADI4蛋白表达情况。结果：1.RA-IC刺激对RA FLSs增殖的影响与对照组OA-IC组和空白对照组(BC)相比,四种浓度(25μg/ml、50μg/ml、 100μg/ml、200μg/ml)的ACPA-IC刺激FLSs 48h后,对FLSs增殖有一定抑制作用,且在25μg/ml、50μg/ml和100 μ g/ml三个浓度均有统计学意义(P0.01),但随着浓度的升高,抑制作用逐渐减弱；OA-IC和BC组相比,对FLSs的增殖无作用。2.关节液RA-IC刺激对RA FLSs分泌CKs功能的影响ACPA-IC刺激FLSs 24-72h后,在细胞培养上清中可测到大量IL-6、IL-8、 GM-CSF和MMP-3,其水平显著高于OA-IC刺激组(P0.05)。其中50μg/ml、 100μg/ml和200 μ g/ml的RA-IC组刺激后,FLSs分泌GM-CSF和IL-6量均显著高于OA-IC组和BC组。RA-IC刺激FLSs分泌IL-8的作用最强,四种刺激浓度,其含量均明显高于OA-IC组与BC组,且差异显著(P0.01)。而MMP-3仅在RA-IC刺激浓度为100 μ g/ml和200μ g/ml时,与OA-IC组和BC组存在显著性差异(P0.01)。提示低浓度时,关节液RA-IC对FLSs刺激MMP-3分泌作用较弱。OA-IC组与BC组间刺激作用差异并不明显,仅在低浓度时,两组MMP-3分泌水平存在些许差异。同时,三组中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3分泌水平均随着时间增加而增加,说明二者间也存在一定正相关性。3.滑膜组织提取蛋白鉴定分别取等量RA和OA患者滑膜组织提取蛋白混合,蛋白质定量后用于后续实验。SDS-PAGE鉴定结果显示,RA组出现若干OA组中没有的条带,在电泳图上25KDa和55KDa位置可见两条深染条带,分别为抗体Ig的轻链和重链部分。4.RA、OA患者ST PADI4表达水平RA患者ST的PADI4的表达水平明显高于OA患者(P0.05),但未发现其表达水平的高低与患者血清中抗CCP、RF、CRP和ASO水平存在相关关系。结论：1.RA患者关节液中较高水平的ACPA-IC对FLSs增殖具有一定抑制作用,随刺激浓度升高抑制作用逐渐减弱,但低刺激浓度和更高刺激浓度的作用尚需进一步的实验证实。2.RA患者关节液IC可刺激FLSs分泌高水平的IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3,提示ACPA-IC中含有的瓜氨酸化蛋白(citrullinated protein,CitP)或ACPA可能在刺激FLSs分泌CKs和MMPs的过程中发挥重要作用。3.SDS-PAGE鉴定结果显示,RA组存在若干OA组中没有的条带,其中可能含有瓜氨酸化的蛋白及可与鼠抗PADI4抗体结合的抗原成分。4.通过检测RA及OA患者ST PADI4的表达水平,发现RA患者ST的PADI4的表达水平明显高于OA患者,但其表达水平的高低可能与患者血清中抗CCP、 RF、CRP和ASO水平并不存在相关关系。
[Abstract]:Background : Rheumatoid arthritis ( RA ) is a kind of autoimmune disease characterized by symmetry and destruction . Although the pathogenesis of RA is not clear , the study shows that autoimmune response plays an important role in the pathological process of RA . In recent years , it has been found that there are a variety of autoantigens , anti - cyclic peptide antibody ( ACPA ) and immune complex ( IC ) in the blood , synovial fluid and cartilage tissue surface of RA patients . In this study , it is necessary to study the function of synoviocytes in RA patients , and it is necessary to study the effects of various inflammatory mediators such as cytokine , CKs and matrix metalloproteinases . PADI is a kind of non - standard amino acid . It is a kind of non - standard amino acid . The effects of ACPA - IC on the proliferation of FLSs were studied by Western blot . The levels of IL - 6 , IL - 8 , GM - CSF and MMP - 3 in RA and OA patients were determined .
The expression of IL - 6 , IL - 8 , GM - CSF and MMP - 3 in patients with RA and OA were detected by ELISA . Results : 1 . The effect of RA - IC stimulation on the proliferation of FLSs was detected by Western blot . Results : 1 . The effect of RA - IC stimulation on the proliferation of FLSs was statistically significant ( P0.01 ) .
The levels of IL - 6 , IL - 8 , GM - CSF and MMP - 3 in RA - IC were significantly higher than those in OA - IC and BC groups . There is no correlation between RF , CRP and ASO levels .
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.22

【参考文献】