高糖水平对成纤维细胞衰老的影响及其作用机制的实验研究

发布时间：2018-06-13 09:50

本文选题：成纤维细胞 + 细胞衰老　；参考：《天津医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:探讨高糖水平在成纤维细胞衰老的过程中起到的作用,以及相关的作用机制。方法:(1)建立高糖模型观察细胞形态变化,将NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)在DMEM培养基中培养,调整对照组葡萄糖浓度,使其保持在5.56mmol/L,而高糖组葡萄糖浓度则需达到33.33mmol/L;将WI-38细胞(人胚肺成纤维细胞)在加入1%NEAA(非必需氨基酸)的MEM培养基中培养,调整对照组葡萄糖浓度为5.56mmol/L;高糖组葡萄糖浓度调整为33.33mmol/L。在37℃,5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养,每天观察细胞形态并拍照,每隔72小时换液,细胞密度达到90%时传代培养。(2)应用β-gal(半乳糖苷酶)细胞衰老染色法,检测细胞衰老。取部分第10天、20天、30天、45天、60天的细胞进行消化,种植在6孔板上,第二天进行β-gal细胞衰老染色,取热点部位进行计数与拍照,计算衰老细胞所占比例,并运用SPSS20.0软件进行两独立样本t检验,设置统计标准为α0.05。(3)MTT细胞增殖实验检测细胞活性。将部分第10天、20天、30天、45天、60天的细胞进行消化,种植在96孔板上,加入DMSO试剂、MTT试剂等,用酶联检测仪OD490处测每孔吸光度,并运用SPSS20.0软件进行两独立样本t检验,设置统计标准为α0.05。(4)运用q RT-PCR(定量反转录聚合酶链式反应)法,检测p16的m RNA表达变化。取部分第10天、30天、60天的细胞,培养在6孔板上,第二天用Trizol RNA抽提试剂提取RNA,并进行q RT-PCR试验,按照公式2-ΔCt=2-(目的基因Ct-管家基因Ct)来计算p16基因的相对表达量。运用SPSS20.0软件进行两独立样本t检验,设置统计标准为α0.05(5)运用蛋白印迹(Western blot)法,检测p16基因的蛋白表达变化。取部分第10天、30天、60天的细胞,培养在6孔板上,第二天用Western及IP裂解液裂解细胞并提取总蛋白,进行Western blot试验,对得到的图像进行灰度测定,运用SPSS20.0软件进行两独立样本t检验,设置统计标准为α0.05。结果(1)细胞形态变化:高糖组与对照组随着时间变化,细胞形态发生明显差异性,高糖组的细胞体积较同时期的对照组细胞大,细胞内色素沉着更丰富,细胞核更大,分叶更多。(2)β-半乳糖苷酶细胞衰老染色显示,对照组与高糖组衰老细胞的比例随时间的增长而差异越明显,高糖组NIH3T3细胞衰老的比例在第45天、第60天明显高于对照组细胞,差异具有统计学意义;而高糖组的WI-38细胞在第30天、第45天、第60天衰老细胞的比例也明显高于对照组,差异具有统计学意义,p0.05。(3)MTT细胞增殖实验的结果表明,随着时间的增长,NIH3T3与WI-38两种细胞的高糖组细胞增殖速率明显低于对照组,在第30天、第45天、第60天,差异均具有统计学意义,p0.05。(4)q RT-PCR的结果显示,高糖组细胞的p16基因转录水平提高,且在第30天、第60天的差异具有统计学意义,p0.05。(5)Western blot实验的结果显示,高糖组细胞的p16蛋白表达水平上升,且在第30天、第60天的差异具有统计学意义,p0.05。结论:(1)高糖水平能够使细胞衰老。实验设计中两组细胞只有糖浓度的不同,因此细胞的一系列变化均为高糖水平导致。(2)高糖水平导致p16基因表达上调。(3)p16基因表达上调可能是高糖水平导致成纤维细胞衰老的重要机制。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of high glucose level on the aging of fibroblasts and the mechanism of action . Methods : ( 1 ) To establish a high glucose model to observe the morphological changes of cells . The cells were cultured in DMEM medium supplemented with 1 % NEAA ( non - essential amino acid ) . ( 4 ) The expression of p16 gene was detected by using q - RT - PCR ( quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ) . The expression of p16 gene was detected by Western blot . ( 3 ) The results of MTT cell proliferation assay showed that , with the increase of time , the proliferation rate of the high - sugar group cells was significantly lower than that of the control group .
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2

【参考文献】