丝裂霉素C对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖凋亡的影响及机制

发布时间：2018-08-25 16:30

【摘要】：目的:本文观察丝裂霉素C能否抑制体外培养的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖并诱导其凋亡,并初步探讨诱导凋亡的机制。方法:1、取类风湿性关节炎患者的滑膜组织进行原代细胞的分离及培养,并通过倒置相差显微镜观察观察滑膜成纤维细胞的形态。2、分别采用不同浓度的MMC(0、10、25、50、100 mg/L)处理FLS不同时间(0、6、12、24、48 h)后用CCK-8比色法检测MMC对FLS增殖活性的影响。应用50 mg/L MMC处理FLS不同时间(0、6、12、24、48 h)后用流式细胞仪及原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测MMC对细胞凋亡的影响,采用流式细胞技术检测50 mg/L MMC作用FLS不同时间(0、1、3、6、12、24 h)后对细胞内活性氧产生的影响,通过Western blot法检测线粒体凋亡蛋白表达情况。结果:1、丝裂霉素C对FLS增殖的影响:CCK-8法结果显示丝裂霉素C可呈时间和剂量依赖性抑制RA FLS的增殖,其中当50 mg/L MMC作用FLS 24 h细胞存活率约为50%。2、丝裂霉素C可诱导FLS发生凋亡:流式细胞仪AV/PI双染法结果显示经50 mg/L MMC处理0、6、12、24、48 h后,随着处理时间的延长细胞凋亡率逐渐增加,凋亡细胞计数显示MMC处理FLS 12 h以上细胞凋亡率显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。此外,我们还采用TUNEL法来检测RA FLS的凋亡,FLS经50 mg/L MMC作用不同时间后,TUNEL的阳性率随着作用时间的延长而逐渐升高,差异有统计学意义(P0.05)。3、丝裂霉素C对细胞内活性氧产生的影响:经50 mg/L MMC处理FLS不同时间(0、1、3、6、12、24 h)后,流式细胞技术检测结果显示与对照组相比,实验组细胞内活性氧的产生明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。4、丝裂霉素C对RA FLS线粒体功能以及线粒体凋亡相关蛋白的影响:为研究MMC导致的RA FLS凋亡后是否与细胞线粒体功能障碍有关,我们采用JC-1免疫荧光染色法来检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψm)的改变。经MMC处理后,荧光结果显示FLS线粒体膜电位降低。此外,Western blot结果显示50mg/L MMC处理RA FLS可增加Bax蛋白的表达水平,降低Bcl-2蛋白的表达水平,并促进Caspase-9、Caspase-3以及PARP的活化裂解(P0.05),且呈时间依赖性。我们进一步检测了从线粒体内向细胞浆中释放的细胞色素C的含量,结果显示经MMC作用后细胞浆中细胞色素C的含量明显增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1、丝裂霉素C可在体外抑制类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖性。2、丝裂霉素C可诱导类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞发生凋亡。3、丝裂霉素C可能是通过线粒体途径诱导类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞凋亡。
[Abstract]:Aim: to investigate whether mitomycin C can inhibit the proliferation and induce apoptosis of synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis in vitro and to explore the mechanism of inducing apoptosis. Methods the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis was isolated and cultured. The morphology of synovial fibroblasts was observed by inverted phase contrast microscope. The effect of MMC on the proliferation of FLS was detected by CCK-8 colorimetric assay after FLS was treated with different concentrations of MMC (01010U 2550100 mg/L) for 48 h. The effect of MMC on apoptosis was detected by flow cytometry (FCM) and in situ terminal transferase labeling (TUNEL) after 50 mg/L MMC treatment of FLS for 48 h. Flow cytometry (FCM) was used to detect the effects of 50 mg/L MMC on the production of reactive oxygen species (Ros) in the cells at different time points (0 ~ (-1) and 12 ~ (12) h, and the expression of mitochondrial apoptotic protein was detected by Western blot method. Results the effect of mitomycin C on the proliferation of FLS showed that mitomycin C could inhibit the proliferation of RA FLS in a time-and dose-dependent manner. The survival rate of FLS cells treated with 50 mg/L MMC for 24 h was about 50. 2, mitomycin C could induce apoptosis of FLS. The results of flow cytometry AV/PI double staining showed that after 50 mg/L MMC treatment, the apoptotic rate increased gradually with the prolongation of treatment time. Apoptotic cell count showed that the apoptosis rate of FLS treated with MMC for more than 12 h was significantly higher than that of control group (P0.05). In addition, TUNEL assay was used to detect the positive rate of Tunel in RA FLS treated with 50 mg/L MMC for different time, and the positive rate of Tunel increased with the prolongation of time. The effect of mitomycin C on the production of reactive oxygen species (Ros): after 50 mg/L MMC treatment of FLS for 24 h, flow cytometry showed that the results of flow cytometry were higher than those of control group. In the experimental group, the production of reactive oxygen species increased significantly. The effect of mitomycin C on mitochondrial function of RA FLS and mitochondrial apoptosis-related protein: in order to study whether the apoptosis of RA FLS induced by MMC is related to mitochondrial dysfunction, the difference was statistically significant (P0.05) .4. The changes of mitochondrial membrane potential (mitochondrial membrane potential, 螖 蠄 m) were detected by JC-1 immunofluorescence staining. After treated with MMC, the fluorescence results showed that the mitochondrial membrane potential of FLS was decreased. In addition, the results of Western blot showed that 50mg/L MMC treatment could increase the expression of Bax protein, decrease the expression of Bcl-2 protein, and promote the activation of Caspase-9,Caspase-3 and PARP (P0.05) in a time-dependent manner. The content of cytochrome C released from mitochondria inward cytoplasm was further determined. The results showed that cytochrome C content in cytoplasm was significantly increased after treatment with MMC, and the difference was statistically significant compared with the control group (P0.05). Conclusion in vitro, mitomycin C can inhibit the proliferation of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis. In a time-and dose-dependent manner, mitomycin C could induce apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis, and mitomycin C might induce apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis through mitochondrial pathway.
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.22

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本文编号：2203470