甲氨蝶呤联合环磷酰胺逆转类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞P-糖蛋白介导的耐药机制的研究

发布时间：2018-12-11 10:37

【摘要】：背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎及血管翳形成为主要病理特征的慢性系统性自身免疫性疾病,其致残率高。以甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)为代表的改善病情抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)药物是RA治疗的首选药物,但临床上存在多药耐药现象(multiple drug resistance,MDR)。多药耐药基因1(MDR1)编码的膜转运蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)可介导药物排出增加,这被认为可能是多药耐药性产生的关键机制。最新研究发现,RA致病机制中的关键因子-白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及其下游信号转导通路在MDR产生中发挥重要作用。但是RA滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synocytes,FLS)上,IL-6对P-gp的调控作用如何,MTX耐药现象与P-gp具体机制相关研究甚少。本文通过建立滑膜成纤维细胞体外培养体系,研究IL-6对RA-FLS上P-gp的调控作用,比较分析MTX单药及MTX联合小剂量CTX两种疗法在诱导耐药蛋白P-gp方面的差别及其具体机制。目的:通过检测RA患者滑膜细胞上P-gp及JAK2-STAT3信号通路蛋白的水平,分析不同浓度IL-6、MTX单药和MTX联合小剂量CTX两种治疗方案诱导P-gp水平的差异及其可能参与的信号转导通路,明确IL-6对FLS上P-gp的调控作用及信号通路,进而探讨MTX联合CTX逆转RA患者多药耐药性的具体机制。方法:通过细针滑膜穿刺活检术提取3例RA初治患者滑膜组织,探索建立滑膜成纤维细胞体外培养体系,培养至V代左右进行实验:第一部分,IL-6对RA-FLS P-gp表达的影响及机制研究:(1)不同浓度IL-6对RA-FLS P-gp表达水平的影响研究:将FLS分为A、B、C、D 4组,分别加入不同处理:A组为细胞对照组,B组加入低浓度的IL-6(4ng/ml),C组加入中浓度IL-6(20ng/ml),D组加入高浓度IL-6(100ng/ml),观察不同浓度IL-6对P-gp表达水平的影响;(2)IL-6调控FLS P-gp过程的信号转导通路研究:将FLS分为A、B、C、D 4组,分别加入不同处理:A组为细胞对照组,B组加入IL-6(100ng/ml),C组、D组分别加入JAK2-STAT3通路抑制剂AG490(50μmol/L)、ERK1/2通路抑制剂PD98059(20μmol/L)预处理30分钟后,再加入IL-6(100ng/ml),观察参与IL-6调控P-gp过程的信号转导通路;第二部分,MTX±CTX对RA-FLS P-gp的影响及其机制研究:将FLS分为A、B、C、D、E 5组,分别加入不同处理:A组为细胞对照组,B、C组分别加入MTX(0.01μg/ml)、MTX(0.01μg/ml)+CTX(1μg/ml),D、E组加入AG490(50μmol/L)预处理30分钟后,再分别加入MTX、MTX+CTX,观察MTX±CTX对P-gp表达的影响,研究参与MTX±CTX调控P-gp过程的信号转导通路。将处理好的FLS放置于37℃C02恒温培养箱中,饱和湿度下培养72小时后收集细胞,行流式细胞术检测滑膜细胞膜蛋白P-gp表达水平,RT-PCR方法检测滑膜细胞P-gp、JAK2、STAT3 m RNA的合成水平,Cell-based ELISA技术检测滑膜细胞p-STAT3的蛋白水平,MTT实验观察滑膜细胞抑制率,分析IL-6、药物、通路抑制剂对RA患者滑膜细胞P-gp的影响。结果:1、与对照组相比,各IL-6浓度组的P-gp表达增加,P-gp m RNA合成增多,差异有统计学意义(P0.05),其他各组之间两两比较差异均有统计学意义(P0.05);比较各组细胞抑制率,IL-6高浓度组细胞抑制率高于IL-6低浓度组,差异有统计学意义(P0.05),其他各组之间差异无统计学意义(P0.05);2、与对照组相比,IL-6组P-gp表达增加,P-gp m RNA合成增多,JAK2、STAT3m RNA合成水平、p-STAT3蛋白水平增加,差异有统计学意义(P0.05);与IL-6组相比,AG490+IL-6组及PD98059+IL-6组P-gp的表达均有下降,P-gp m RNA合成均减少;AG490+IL-6组和PD98059+IL-6组相比,差异有统计学意义,AG490+IL-6组P-gp下降趋势更明显(P0.05);与IL-6组相比,AG490+IL-6组的JAK2、STAT3m RNA合成水平、p-STAT3蛋白水平均有下降,差异有统计学意义(P0.05);比较各组细胞抑制率,两两比较细胞抑制率无统计学差异(P0.05);3、与对照组相比,各药物组P-gp表达增加,P-gp m RNA合成增多,差异有统计学意义(P0.05);与MTX组相比,MTX+CTX组P-gp表达较少,P-gp m RNA合成较少,差异有统计学意义(P0.05);加入通路抑制剂进行预处理后,P-gp表达较无通路抑制剂组降低,P-gp m RNA合成减少,JAK2、STAT3 m RNA合成水平、p-STAT3蛋白水平亦下降,差异有统计学意义(P0.05);比较各组细胞抑制率,两两比较细胞抑制率无统计学差异(P0.05)。结论:1、IL-6上调RA-FLS P-gp表达,有一定浓度依赖性;2、IL-6上调RA-FLS P-gp表达过程中有JAK2-STAT3和ERK1/2通路的参与,以JAK2-STAT3通路为著;3、MTX或MTX联合CTX均可通过JAK2-STAT3通路上调RA-FLS P-gp表达;4、MTX联合CTX可削弱MTX单药对JAK2-STAT3通路的激活作用,进而一定程度上逆转P-gp表达。
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【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R593.22

【参考文献】