AngⅡ受体拮抗剂坎地沙坦对高糖诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及机制研究

发布时间：2019-03-29 09:50

【摘要】：目的观察坎地沙坦(Cand)对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞株A7r5增殖和分泌血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的影响,并探讨其机制。方法根据葡萄糖浓度将A7r5细胞分为两组,正常糖浓度组(NG,5m M)、高糖组(HG,15、25、35、45m M)将各组细胞培养48h后,采用CCK-8法测定培养基吸光度值(OD值)以确定最佳葡萄糖浓度。再按照该浓度分别培养A7r5细胞0、24、48、72h后用CCK-8法测定培养基OD值以确定最佳培养时间。用选定的葡萄糖浓度及培养时间进行下一步实验。Cand选定了3个浓度,分别为HG(25m M)+Cand10-7mol/L、HG(25m M)+Cand10-6mol/L、HG(25m M)+Cand10-5mol/L,采用CCK8法测定OD值,从中择选出最佳浓度进行下一步实验。最终分为NG(5m M)、HG(25m M)、HG(25m M)+Cand10-5mol/L三组,采用细胞计数法和流式细胞术检测A7r5增殖情况,以评价Cand对于高糖诱导的A7r5增殖的影响。采用ELISA法检测细胞分泌AngⅡ水平、细胞免疫荧光染色法测定细胞膜表面AT1R。最后采用Western blot法检测p-c-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平以探讨Cand对A7r5增殖和分泌AngⅡ影响的机制。结果1、(1)CCK-8法测定最佳葡萄糖浓度:细胞培养48h后,与NG(5m M)组相比,HG(15、25、35、45m M)浓度下诱导的A7r5细胞,OD值均明显升高,且以HG(25m M)组OD值为(1.044±0.074)增高最为明显,与NG(5m M)OD值(0.681±0.055)相比差异有统计学意义(P0.01);(2)CCK-8法测定最佳培养时间:HG(25m M)组细胞培养0h(0.436±0.006)相比较,细胞培养24h(0.717±0.018)、48h(1.044±0.074)、72h(1.062±0.067)OD值均明显升高,差异均有统计学意义(P均0.01)。而48h和72h相比,其OD值差异无显著性(P0.05);(3)CCK-8法测定最佳Cand浓度:A7r5细胞经48h培养后,HG(25m M)+Cand10-5mol/L组OD值为(0.920±0.010),与HG(25m M)组OD值(1.126±0.080)相比有明显统计学差异(p0.01),而HG(25m M)+Cand10-7mol/L、HG(25m M)+Cand10-6mol/L组较HG(25m M)组无统计学差异(p0.05)。(4)细胞计数法结果:A7r5细胞培养48h后,与HG(25m M)组细胞计数结果(77.33±2.52)相比,HG(25m M)+Cand10-5mol/L组细胞数(64.67±1.16)明显减少,两组差异有统计学意义(p0.01)。(5)流式细胞术结果显示,与NG(5m M)组比较,HG(25m M)组A7r5细胞增殖活性明显增强,细胞周期S期比例[(30.503±1.521)%]明显增加(P0.01)。与HG(25m M)组比较,HG(25m M)+Cand10-5mol/L组A7r5细胞增殖活性下降,细胞周期S期比例[(21.677±1.690)%]下降,两组差异有统计学意义(p0.01)。2、(1)ELISA法测AngⅡ结果显示:NG(5m M)组OD值为(55.268±0.310)与HG(25m M)组OD值(59.934±0.121)相比,有统计学差异(p0.01)。而HG(25m M)+Cand10-5mol/L组与HG(25m M)组相比无统计学差异(p0.05)。(2)细胞免疫荧光染色法测定结果:与NG(5m M)组比较,HG(25m M)组细胞膜上AT1R表达增加,与HG(25m M)比较,HG(25m M)+Cand10-5mol/L组AT1R表达减少。3、Western blot结果显示:与NG(5m M)组p-c-Raf(0.836±0.039)、p-MEK1/2(1.032±0.034)、p-ERK1/2(1.472±0.089)比较,HG(25m M)组p-c-Raf(1.060±0.087)、p-MEK1/2(1.155±0.064)、p-ERK1/2(1.924±0.065)蛋白质表达水平明显上调(p0.01)。与HG(25m M)组相比,HG(25m M)+Cand10-5mol/L组p-c-Raf(0.658±0.039)、p-MEK1/2(0.821±0.049)、p-ERK1/2(0.795±0.028)蛋白表达下调(p0.01)。结论1.高糖促进A7r5增殖、升高AngⅡ分泌水平。2.坎地沙坦抑制高糖诱导的A7r5细胞增殖,但对AngⅡ分泌无影响。3.坎地沙坦抑制高糖诱导的A7r5细胞增殖其机制可能与抑制p-c-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平有关。
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【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2

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本文编号：2449408