白介素-23诱导破骨细胞表达成骨分子

发布时间：2019-04-29 17:06

【摘要】：研究目的:强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种主要危害男性青壮年,以炎性腰背痛为主要症状,导致骶髂关节强直和脊柱强直的疾病,其病理特征是肌腱端炎、骨侵蚀、骨赘(新骨)形成。迄今为止,AS新骨形成的发生机制尚不清楚。目前有证据提示IL-23在AS新骨形成中发挥重要作用。研究发现,IL-23在肌腱端炎症部位既能诱导骨形成,又能诱导骨破坏。IL-23可以通过RANKL等方式调节破骨细胞的分化,但对成骨细胞无直接作用。正常情况下,骨代谢(骨重建)处于骨吸收和骨形成的动态平衡中,破骨细胞与成骨细胞相互作用、相互调节。成骨细胞可通过表达M-CSF、RANKL、OPG等分子调节破骨细胞的分化。破骨细胞可通过表达Ephrin B2、SPHK1、BMP6、Wnt10b等分子,诱导成骨细胞前体向破骨部位趋化,并促进成骨细胞的分化成熟。破骨细胞也可通过增加semaphorin 4D、Htr A1的表达来抑制成骨细胞分化。因此,本实验旨在探究IL-23是否诱导破骨细胞表达Ephrin B2、SPHK1、BMP2、BMP6、Wnt10b、Htr A1等分子,从而间接调节成骨细胞的分化研究方法:首先,采用两种方法诱导破骨细胞,第一种方法是用小鼠骨髓单核细胞诱导破骨细胞。提取6-8周龄的C57/BL6小鼠的骨髓单核细胞,用含有M-CSF(50ng/ml)的完全培养基培养3天。随后实验组用含有M-CSF(50ng/ml)和RANKL(30ng/ml)的完全培养基培养细胞5天,诱导破骨细胞分化。对照组用不加RANKL的培养基培养。用TRAP染色来鉴定破骨细胞。第二种方法是用RAW264.7细胞诱导破骨细胞。实验组是用含有RANKL(30ng/ml)的完全培养基诱导培养RAW264.7细胞5天。对照组用不加RANKL的培养基培养。同样采用TRAP染色鉴定破骨细胞。比较这两种诱导方法诱导破骨细胞的效率,挑选一种诱导效率高的方法用于后续实验,并用real-time PCR方法检测其TRAP、NFATc1的表达情况。其次,用IL-23刺激破骨细胞3h、6h、12h、24h,不加IL-23作为对照组。用real-time PCR的方法检测Ephrin B2、SPHK1、BMP2、BMP6、Wnt10b、Htr A1等分子在m RNA水平的表达情况。最后,用IL-23刺激破骨细胞6h、12h、24h、48h,不加IL-23作为对照组。用western-blot的方法检测Ephrin B2、SPHK1、BMP2、BMP6、Wnt10b、Htr A1等分子在蛋白水平的表达情况。研究结果:1.骨髓单核细胞经M-CSF+RANKL诱导培养5日后,可见许多细胞直径100um,TRAP染色为紫红色,细胞核≥3个的多核巨细胞,即为成熟的破骨细胞。RAW264.7细胞经RANKL诱导5日后,同样可见一些细胞直径100um,TRAP染色为紫红色,细胞核≥3个的多核巨细胞。经比较发现,用小鼠骨髓单核细胞诱导所得的破骨细胞明显多于用RAW264.7诱导所得的破骨细胞。因此后续实验均采用小鼠骨髓单核细胞诱导破骨细胞。用real-time PCR证实小鼠骨髓单核细胞诱导的破骨细胞的TRAP、NFATc1的m RNA表达水平明显高于对照组。表明此方法可诱导破骨细胞,并可用于后续实验。2.诱导的破骨细胞在IL-23刺激3-24h后,经real-time PCR检测发现,Ephrin B2、SPHK1、BMP2在m RNA水平的表达量均增加。Ephrin B2在IL-23刺激破骨细胞3小时的表达量是对照组的2.10倍。IL-23刺激3小时,SPHK1的表达量是对照组的2.30倍,IL-23刺激6h,其表达量是对照组的2.46倍。BMP2在IL-23刺激3小时的表达量较对照组升高1.46倍。采用Western blot进一步证实IL-23可诱导破骨细胞的Ephrin B2及SPHK1的蛋白表达明显增多。3.经real-time PCR检测发现,IL-23刺激破骨细胞后,BMP6、Wnt10b、Semaphorin4D和Htr A1在m RNA水平的表达水平与对照组相比无明显变化。研究结论:IL-23可诱导破骨细胞(小鼠骨髓单核细胞诱导分化而来)表达Ephrin B2、SPHK1、BMP2,但不影响破骨细胞表达BMP6、semaphorin 4D、Wnt10b、Htr A1。提示IL-23可能通过破骨细胞间接诱导成骨细胞的分化成熟。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R593.23
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本文编号：2468379