【摘要】：第一部分BMP9在小鼠下丘脑的表达和分布目的:检测BMP9基因在普食(NCD)和高脂饮食(HFD)喂养的C57BL/6J小鼠及db/db鼠下丘脑分布。方法:利用Western blot技术检测普食和高脂喂养的12周后C57BL/6J以及普食喂养12周后db/db鼠(NCD组、HFD组、db/db组,均n=4)下丘脑BMP9基因表达水平。结果:高脂C57BL/6J小鼠下丘脑BMP9蛋白较普食组明显下降(p0.05),db/db鼠下丘脑BMP9蛋白较普食组明显下降(p0.01)。结论:高脂饮食和肥胖降低下丘脑BMP9蛋白水平。第二部分中枢性BMP9过表达对小鼠肝糖代谢影响目的:侧脑室给予普食(NCD)和高脂饮食(HFD)喂养的C57BL/6J小鼠Ad-BMP9或Ad-GFP,初步探讨中枢性BMP9过表达对小鼠肝脏葡萄糖代谢的影响。方法:7周龄健康雄性C57BL/6J小鼠90只,分别适应性喂养1周后,随机分为普食喂养组(ND组,n=40)和高脂喂养组(HFD组,n=40),均喂养12周。于12周末分别随机侧脑室注射Ad-BMP9或Ad-GFP,分为普食空载组(NCD+Ad-GFP组,n=20),普食BMP9病毒组(NCD+Ad-BMP9组,n=20),高脂空载病毒组(HFD+Ad-GFP组,n=20),高脂BMP9病毒组(HFD+Ad-BMP9组,n=20)。利用Western blot检测测BMP9蛋白表达水平。测定空腹/餐后血糖、摄食及体重变化、血压、血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、呼吸商等,利用腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)、胰岛素耐量试验(ITT)、高胰岛素-正葡萄糖钳夹及组织葡萄糖摄取试验评价各组小鼠肝糖代谢、胰岛素敏感和组织葡萄糖摄取能力变化。结果:普食组给予Ad-BMP9后下丘脑BMP9蛋白水平显著升高,高脂组给予Ad-BMP9后下丘脑BMP9蛋白水平也显著增加。NCD+Ad-BMP9组与NCD+Ad-GFP组相比,小鼠血糖、摄食及体重、血压、血浆TG、TC、FFA、ASL、ALT水平均无统计学差异;HFD+Ad-GFP组较NCD+Ad-GFP组小鼠上述指标均明显升高(p0.05);HFD+Ad-BMP9组较HFD+Ad-GFP组小鼠体重、摄食、餐后血糖、收缩压、舒张压、血浆TG、TC、FFA水平显著升高(p0.05),但ALT、AST水平两组相比无明显差异。NCD+Ad-BMP9组与NCD+Ad-GFP组小鼠相比,RER、VO2无明显差异;而HFD+Ad-BMP9组较HFD+Ad-GFP组小鼠VO2显著升高(p0.05),RER较HFD+Ad-GFP组降低(p0.05)。在钳夹稳态期,NCD+Ad-BMP9组与NCD+Ad-GFP组小鼠相比,葡萄糖输入率(GIR)、葡萄糖清除率(GRd)及肝糖生成(HGP)均无统计学差异(p0.05);而HFD+Ad-BMP9组较HFD+Ad-GFP组小鼠GIR、GRd显著升高(p0.01),HGP则显著下降(p0.01)。NCD+Ad-BMP9组与NCD+Ad-GFP组小鼠相比,脂肪组织和肌肉组织葡萄糖摄取无统计学意义(p0.05);而HFD+Ad-BMP9组较HFD+Ad-GFP组小鼠脂肪组织葡萄糖摄取无统计学差异(p0.05),肌肉组织葡萄糖摄取显著升高(p0.05)。结论:中枢性BMP9改善饮食诱导的胰岛素抵抗和降低外周肝糖产生。第三部分中枢性BMP9基因过表达对高脂喂养小鼠下丘脑相关信号通路和肝糖异生酶的影响目的:通过检测侧脑室给予的Ad-GFP或Ad-BMP9的普食和高脂喂养小鼠肝脏糖异生关键酶和下丘脑胰岛素信号通路包括胰岛素受体(Ins R)、和蛋白激酶B(AKT)以及下丘脑雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K),研究中枢性BMP9基因过表达对下丘脑胰岛素信号通路及mTOR信号通路和肝脏糖异生酶的影响。方法:20只C57BL/6J小鼠,随机分为普食喂养组(NCD组,n=10)和高脂喂养组(HFD组,n=10),均喂养12周。于12周末分别随机侧脑室注射Ad-BMP9或Ad-GFP,分为普食空载组(NCD+Ad-GFP组,n=5),普食BMP9病毒组(NCD+Ad-BMP9组,n=5),高脂空载病毒组(HFD+Ad-GFP组,n=5),高脂BMP9病毒组(HFD+Ad-BMP9组,n=5);利用实时的荧光定量PCR检测各组小鼠侧脑室给予腺病毒后第7天下丘脑NPY、Ag RP、POMC的m RNA,利用Western blot检测下丘脑Ins R、AKT、mTOR、p70S6K和肝脏PEPCK、G6Pase的蛋白表达,利用免疫组化各组小鼠下丘脑c-fos水平。利用免疫荧光检测各组在基础状态下和胰岛素刺激下下丘脑弓状核PIP3的形成情况。结果:NCD+Ad-BMP9组与NCD+Ad-GFP组小鼠相比,下丘脑NPY、Ag RP、POMC的m RNA表达均无明显差异(p0.05);HFD+Ad-BMP9组小鼠下丘脑NPY m RNA表达显著低于HFD+Ad-GFP组(p0.01),下丘脑POMC m RMA显著高于HFD+Ad-GFP(p0.01),而下丘脑Ag RP m RNA两组无统计学差异(p0.05)。NCD+Ad-BMP9组与NCD+Ad-GFP组小鼠相比下丘脑Ins R、AKT、mTOR、p70S6K蛋白磷酸化水平及肝脏PEPCK、G6Pase m RNA和蛋白水平无统计学差异(p0.05);HFD+Ad-BMP9组小鼠下丘脑Ins R、AKT、p70S6K蛋白磷酸化水平显著高于HFD+Ad-GFP组(p0.05或p0.01),肝脏PEPCK、G6PAse m RNA和蛋白水平均显著低于HFD+Ad-GFP组(p0.05或p0.01)。NCD+Ad-BMP9组和NCD+Ad-GFP组小鼠下丘脑有c-fos表达,以室旁核最为密集,但两组差别无统计学差异(p0.05);HFD+Ad-BMP9组小鼠下丘脑室旁核Fos免疫反应性阳性神经元数目较HFD+Ad-GFP组显著增加,差别有统计学意义(p0.05)。高脂饮食下,在基础状态下,Ad-BMP9组与Ad-GFP组下丘脑ARC的中度和高度PIP3形成有所增加,但没有统计学(p0.05),而在胰岛素刺激下,Ad-BMP9组较Ad-GFP组下丘脑ARC的PIP3形成明显增加(p0.05)。结论:在普食状态下,中枢性BMP9基因过表达对小鼠下丘脑胰岛素信号通路、肝脏糖异生酶和下丘脑mTOR信号通路无明显影响;在高脂饮食下,小鼠下丘脑胰岛素信号通路及PIP3分子激活及肝脏糖异生增加,下丘脑mTOR通路激活,中枢性BM9基因过表达可以激活下丘脑胰岛素信号通路和抑制肝糖糖异生,调节mTOR通路,激活c-fos活性,增加PIP3的形成。第四部分中枢性BMP9通过mTOR通路改善高脂诱导胰岛素抵抗目的:探讨中枢性BMP9基因过表达改善下丘脑胰岛素抵抗和肝糖产生是否依赖于下丘脑mTOR通路方法:40只高脂喂养12周的C57BL/6J小鼠,构建右侧脑室微量给药系统,随机分为HFD+Ad-GFP组(n=20)和HFD+Ad-BMP9组(n=20),第7d禁食6h通过侧脑室给药系统注射雷帕霉素(Rapamycin,20ug/2ul)和二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO,分组为:Ad-GFP+DMSO组(n=10),Ad-GFP+rapamycin组(n=10),Ad-BMP9+DMSO组(n=10),Ad-BMP9+rapamycin组(n=10)。利用葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验评价各组小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性变化。利用PCR检测肝脏PEPCK和G6Pase m RNA水平,利用Western blot检测下丘脑mTOR、p70S6K和肝脏PEPCK、G6Pase的蛋白表达。结果:葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验中,Ad-BMP9+DMSO组较Ad-GFP+rapamycin组、Ad-GFP+DMSO组和Ad-BMP9+rapamycin组小鼠血糖和曲线下面积显著减少(p0.05)。Ad-BMP9+DMSO组小鼠下丘脑mTOR、p70S6K蛋白磷酸化水平表达显著高于Ad-GFP+rapamycin组、Ad-GFP+DMSO组和Ad-BMP9+rapamycin组(p0.05或p0.01),肝脏PEPCK、G6Pase m RNA和蛋白水平均显著低于HFD+Ad-GFP组、Ad-GFP+rapamycin组、Ad-GFP+DMSO组和Ad-BMP9+rapamycin(p0.05或p0.01)。结论:中枢性BMP9基因过表达可通过下丘mTOR通路改善高脂饮食诱导的小鼠肝脏胰岛素抵抗和降低肝脏糖异生,增强胰岛素敏感性。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.1
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2513415
