脂肪酸对神经元和星形胶质细胞的损伤机理

发布时间：2020-03-24 21:57

【摘要】：糖尿病(Diabetesmellitus,DM)可以引起以轻、中度认知功能障碍和学习记忆能力下降为主要特征的中枢神经系统并发症,称为糖尿病脑病(Diabetic encephalopathy,DE)。老年糖尿病患者患痴呆的风险是正常同龄人的2倍左右。目前全世界糖尿病患者已高达3.5亿,老年人群中2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患病率可达10%以上,并且约半数以上伴有学习、记忆和认知能力的降低。DE兼具脑血管病变和阿尔兹海默病样改变,发病原因复杂,病理机制仍不清楚。目前认为糖尿病脑微环境例如高糖、高胆固醇、高甘油三酯、高脂肪酸、胰岛素信号紊乱等对中枢神经系统神经元及其支持细胞的损伤是诱发DE的重要因素。星形胶质细胞作为中枢神经系统内数量最多、功能最广泛的一类神经细胞,对脑内离子水平稳态、神经递质释放和摄取、神经元生长发育和信息传递有重要作用。随着研究的深入,基于神经元及其支持细胞病变的机制已逐渐成为DE探究的重点。在课题组以前的研究基础上,本研究分别考察糖尿病脑微环境的高脂或高糖状态对原代培养神经元或星形胶质细胞的影响,并对其损伤机制进行深入研究。工作主要分为以下三个部分:第一部分高糖、高脂对神经元和星形胶质细胞活性的影响通过体外培养的原代神经元和星形胶质细胞的葡萄糖(Glucose,G)或棕榈酸(Palmitic Acid,PA)损伤模型,模拟糖尿病脑病时高游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)和高葡萄糖的脑部微环境对神经元和星形胶质细胞的作用,以期找出DE发病过程中的关键病理因素。本实验从出生12h以内的Wistar乳鼠海马或皮层组织分离培养原代神经元和星形胶质细胞。特异性标记蛋白免疫荧光染色实验表明,原代培养的星形胶质细胞纯度大于98%,神经元细胞纯度大于95%,且生长状态良好。高葡萄糖损伤实验分别采取35mmol·L-1高浓度G、17.5mmol·L-1中浓度G、5.5mmol·L-1低浓度的G、5.5mmol·L-1低浓度G加上17.5mmol·L-1甘露醇(Mannitol,M)的培养基培养神经元或星形胶质细胞,24h、48h和72h后MTT方法检测细胞活性。高脂肪酸损伤实验分别采取0.1mmol·L-1的高浓度PA、0.05mmol·L-1的中浓度PA、0.01mmol·L-1的低浓度的PA、不含PA的正常培养基培养神经元或星形胶质细胞,24h、48h和72h后MTT方法检测细胞活性。结果发现,高糖对星形胶质细胞具有显著的损伤作用,35mmol·L-1 G损伤72h后使星形胶质细胞活性降低20%,高糖对神经元无明显影响;高脂对星形胶质细胞具有显著的损伤作用,O.1mmol·L-1 PA损伤72h后细胞活性降低51%,高脂对神经元无明显影响。表明FFA损伤星形胶质细胞可能是DE的重要病理机制。第二部分棕榈酸引起星形胶质细胞损伤的机制研究第一部分的研究发现FFA损伤星形胶质细胞可能在DE的发生发展中起重要作用,本部分主要对FFA损伤星形胶质细胞的机制进行更加深入的探索。使用 TUNEL 染色法(TdT-mediated dUTPNick-End Labeling,TUNEL)检测细胞凋亡,发现PA可浓度依赖性的诱导星形胶质细胞凋亡。通过流式细胞术检测星形胶质细胞对荧光标记PA类似物BODIPYFLC16的摄取,结果表明分化抗原决定簇36(Cluster of differentiation 36,CD36)在星形胶质细胞摄取脂肪酸过程中发挥重要作用。采用钙离子荧光染料和FLIPR实时荧光记录系统检测细胞内钙离子浓度变化,发现PA可引起IP3R(Inositol trisphosphate receptor,IP3受体)介导的星形胶质细胞内钙释放和内质网钙衰竭。通过CM-H2DCFDA荧光染色检测细胞内氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)水平,结果表明PA可引起星形胶质细胞ROS水平显著增加。CD36抑制剂N-油酰基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-N-succinimidyl oleate,SSO)可以减少PA的摄取及其诱导的星形胶质细胞钙超载,ROS水平升高,线粒体损伤,细胞活性下降和细胞凋亡,谷氨酸摄取能力下降,脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)合成和分泌减少。IP3R 抑制剂二苯基硼酸-2-氨基乙酯(2-aminoethyldiphenylborinate,APB)也可以抑制PA引起的钙超载和ROS水平升高。CD36抑制剂SSO、IP3R抑制剂APB和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)对PA引起的星形胶质细胞活性下降均具有显著抑制作用。综上所述,CD36通过钙超载和氧化应激介导PA诱导的星形胶质细胞凋亡。第三部分神经元和星形胶质细胞对棕榈酸损伤敏感性差异的机制研究第一部分的研究发现高脂肪酸显著损伤星形胶质细胞,对神经元无明显影响。第二部分的研究表明脂肪酸通过CD36介导的钙超载和氧化应激引起星形胶质细胞的凋亡。本部分在上述结果的基础上着重探讨星形胶质细胞和神经元对脂肪酸损伤敏感性不同的分子机制。通过Western-blot和流式细胞技术检测脂肪酸转位酶CD36在原代培养的星形胶质细胞和神经元的表达量,结果发现星形胶质细胞CD36表达量约为神经元的2.1倍。进一步使用流式细胞术检测两种细胞对荧光标记PA类似物BODIPYFLC16的摄取,结果发现星形胶质细胞对PA的摄取率约为神经元的6.4倍。PA可以强烈促进星形胶质细胞内质网钙释放,与星形胶质细胞相比PA促进神经元内质网钙释放作用较弱,相同的条件下PA损伤可以使星形胶质细胞内质网钙含量下降约80%而神经元内质网钙含量下降约25%。由此可见CD36表达量决定星形胶质细胞和神经元对脂肪酸损伤的敏感程度。转染CD36-pcDNA3.1质粒,使神经元过表达CD36之后,PA对神经元的损伤作用显著增强。转染CD36siRNA,使星形胶质细胞CD36表达减少,PA对星形胶质细胞的损伤作用显著减弱。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2

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本文编号：2598917