锰中毒大鼠脑纹状体基因表达差异分析

发布时间：2020-03-26 00:15

【摘要】：【研究目的】研究锰染毒后大鼠纹状体基因表达谱的改变,探讨锰致多巴胺能神经元损伤的分子机制,进一步探索锰中毒发生的基因靶点,寻求锰中毒生物治疗途径。【研究方法】1.本研究采用以25mg/kg MnCl_2·4H_2O,0.2ml/100g进行腹腔注射,每48h注射一次,对SD大鼠暴露1个月后冰上取大鼠脑纹状体组织并立即倒入液氮,提取纹状体RNA并检测总RNA浓度、RNA完整性数(RIN)28S/18S值和片段大小,建立基因文库。2.采用Agilent 2100 Bioanalyzer及ABI StepOnePlus Real-Time PCR System两种方法对基因文库进行检测,Agilent2100 Bioanalyzer检测文库的插入片段范围,ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库进行浓度的定量。同时进行数据的过滤,去除接头污染、未知碱基过高及低质量读数,获得清洁读数(clean reads)。3.使用HISAT将clean reads比对到参考基因组序列。与参考基因组比对之后,使用StringTie对每个样品进行转录本重构,然后使用Cuffcompare将重构的转录本与参考注释信息比较,挑选新转录本,并用CPC软件对新转录本进行编码潜力的预测,最终将预测具有蛋白编码潜力的新转录本加入到参考基因序列中,得到一个完整的参考序列信息,后续基于此参考序列进行分析。4.使用DEseq2和PossionDis两种算法进行差异基因检测,筛选FDR≤0.001且倍数差异在2倍以上的基因,定义为差异表达基因。利用GO功能及KEGG数据库进一步对差异表达基因进行功能性分析,并利用String数据库筛选差异表达基因的互作基因并进行相关分析。5.对筛选出的差异表达基因及其互作基因进行RT-PCR验证,对比全基因组分析及PCR验证实验结果,分析差异表达基因可能的分子调控机制。【研究结果】1.建库测序之前对各个样品进行质量检测,本研究各个样品,浓度均达到50ng/μl,RIN值均大于8.0,28S/18S均大于1.3,RNA总量充足,无DNA、蛋白/盐离子等污染,样品无色透明不粘稠,说明样品符合测序质量检测标准,可以建立基因文库。2.使用Illumina HiSeq平台进行检测,平均每个样品生成6.72Gb数据。样品比对到基因组的平均比对率为88.12%,基因文库中各样品Clean Reads Q20(%)值均大于98%,Clean Reads Q30(%)值均大于95%,表明测序质量良好。3.共筛选出17个差异表达基因,其中7个基因显著下调,10个基因显著上调,差异基因中仅有5个基因为已知基因,分别为:Sgk1、Pnpla1、Grm2、HCRTr1、RT1-CE16,其他基因为未知的新基因。GO功能富集分析发现差异表达基因在行为功能部分富集程度最高(P=0.02281)。Pathway功能富集发现差异基因多富集在神经活性配体-受体相互作用、谷氨酸能代谢等神经传导途径以及FoxO信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路等细胞凋亡途径。4.根据基因功能及互作效应筛选出HspB1,Rem2,Oprd1,ATF5以及TRHr五个基因可能参与锰中毒致病机制,上述基因与其互作差异基因的互作得分分别为:726、907、231、191、900。RT-PCR验证实验与基因测序结果基本一致,但Sgk1、Pnpla1、ATF5以及TRHr验证结果无统计学差异(P0.05)。5.差异基因与互作基因相关性分析结果发现Rem2和TRHr均与HCRTr1显著相关,Rem2与HCRTr1呈负相关关系(r=-0.782,P0.05),TRHr与HCRTr1呈正相关关系(r=0.707,P0.05),Rem2和TRHr之间也为负相关关系(r=-0.651,P0.05)。RT1-CE16与Oprd1之间存在负相关关系(r=-0.502,P0.05)。未知基因novel_G001016的两个互作基因HspB1与ATF5之间无相关性。【研究结论】1.筛选的17个差异基因,初步通过GO分析、Pathway功能分析确定基因功能,发现差异基因涉及PI3K-Akt、mTOR、FoxO等细胞凋亡相关通路以及谷氨酸代谢、神经活性受体-配体作用等。2.利用String数据库,观察差异基因的互作基因,推测HspB1、Rem2、Oprd1、ATF5、TRHr基因可能参与锰中毒致病机制。3.全基因组测序与RT-PCR验证结果基本一致,但个别基因验证结果无统计学差异,考虑可能由于样品个体差异的原因,还需重复实验验证。筛选出的锰中毒差异表达基因还需进一步功能实验确定其表达调控机制以及对锰中毒的影响。
【图文】：

锰中毒大鼠脑纹状体基因表达差异分析样品碱基质量处于较高水平，表明测序质量良好（表 2，图 1）。表 2 纹状体基因文库过滤后 reads 质量统计SampleTotal RawReads(Mb)Total CleanReads (Mb)Total CleanBases (Gb)Clean ReadsQ20 (%)Clean ReadsQ30 (%)Clean ReadsRatio (%)CS1 50.62 45.19 6.78 98.60 95.75 89.28CS2 50.25 45.35 6.80 98.47 95.41 86.78CS3 50.62 44.09 6.61 98.49 95.47 87.11ES1 52.25 45.15 6.77 98.44 95.34 86.40ES2 50.62 44.40 6.66 98.53 95.56 87.71ES3 50.62 44.62 6.69 98.56 95.64 88.14注：Sample 为样品名；Total Raw Reads(Mb)代表过滤前的 reads 数；Total Clean Reads(Mb)表示过滤后的 reads 数；Total Clean Bases(Gb)为过滤后的碱基总数；Clean Reads Q20(%)是指过滤后的 reads 中质量值大于 20 的碱基数占总碱基数的比例；Clean Reads Q30(%)是指过滤后的 reads 中质量值大于 30 的碱基数占总碱基数的比例；Clean ReadRatio(%)为过滤后的 reads 比例。

锰中毒大鼠脑纹状体基因表达差异分析50,670 49,800 100,470 10,081 9,059 8,849 10,075 38,064 51,498 51,160 102,658 10,708 9,326 9,108 10,457 39,599 50,404 50,114 100,518 10,099 9,125 8,734 10,135 38,093 56,179 55,964 112,143 11,528 10,349 9,874 11,298 43,049 发生转换变异的 SNP 数目，，Transversion 指发生颠换变异的 SNP 数。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R595.2

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本文编号：2600643