分泌型Osteopontin通过CD44依赖的PI3K-AKT通路促进白色脂肪细胞棕色化

发布时间：2020-03-26 19:06

【摘要】：目的:骨桥蛋白(OPN)是一种分泌的多功能糖蛋白,参与免疫反应、炎症、肿瘤形成和代谢等多种病理生理过程。OPN以两种形式存在,即分泌型OPN(sOPN)和胞内型OPN(iOPN)。尽管它们可能具有不同的生物学活性,但它们对棕色脂肪细胞分化的影响尚未完全阐明。因此,本研究旨在探讨sOPN在白色脂肪棕色化中的作用及其机制,并探讨未修饰人重组OPN(rhOPN)作为iOPN的替代物,是否具有类似的作用和机制。方法:首先,3T3-L1前脂肪细胞分别用含有rhOPN(10,50,100,200μM)的DMI诱导培养基诱导培养,并设置用含磷酸盐缓冲液(PBS)的培养基代替rhOPN处理的为Vehicle组,诱导分化6天后,设立分组为Ctrl组、Vehicle组、rhOPN(200μM)组;另一方面,用特异性腺病毒Ad-GFP-ap2-OPN感染另一组3T3-L1细胞后用DMI诱导培养基诱导分化,并同时用阴性对照腺病毒(Vehicle)处理作为对照,设立分组为Ctrl组、Vehicle组、Ad-GFP-ap2-OPN组。其次,分别用CD44抗体和免疫球蛋白(Ig G)处理感染过特异性腺病毒Ad-GFP-ap2-OPN的细胞,并如上述方法诱导培养6天,分别设置anti-CD44组、Ig G组。最后,检测以下指标:(1)通过MTS法检测rhOPN处理3T3-L1细胞后的细胞活力;(2)通过ELISA法检测sOPN的表达水平;(3)油红O染色观察3T3-L1细胞诱导后细胞内脂质聚集情况;(4)Western blotting法分别检测与棕色脂肪细胞分化相关的markers如UCP-1、PRDM16、PGC-1α、PPARγ等蛋白表达水平;检测细胞中p-PI3K、PI3K、AKT、AKT-pS473的蛋白表达水平以探讨作用机制。结果:(1)油红O染色结果显示:诱导培养6天时,细胞内脂质大量聚集,脂肪细胞基本诱导成熟。(2)用不同滴度特异性腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染3T3-L1细胞后,在荧光倒置显微镜下观察,发现脂肪细胞在病毒滴度为1×10~8PFU感染48h时细胞未见明显损伤并且绿色荧光强度最高。因此,本实验选择最佳感染病毒滴度为1×10~8PFU,最佳感染时间为48h。(3)ELISA法检测结果显示:用特异性腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染3T3-L1细胞后分泌sOPN的水平上升。(4)MTS法检测结果显示:用由不同浓度的rhOPN来替代欠修饰的iOPN处理脂肪细胞后,细胞活力没有受到明显的影响。(5)油红O结果显示:感染特异性腺病毒上调sOPN后,细胞内脂质大量聚集,而用rhOPN处理后细胞内脂质并没有明显聚集现象。(6)Western blotting测定结果显示:用腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染的3T3-L1细胞内UCP-1、PRDM16、PGC-1α和PPARγ等蛋白的表达水平显著升高;而用rhOPN处理后的细胞内上述相应蛋白却没有明显的上升趋势。(7)确认sOPN上调促进白色脂肪细胞棕色化后,油红O结果显示:用CD44抗体中和CD44受体后,对比空白对照Ig G组,细胞内脂质聚集受到明显的抑制。(8)Western blotting测定结果显示:对比空白对照Ig G组,中和CD44受体后,UCP-1、PRDM16、PGC-1α和PPARγ等棕色化相关蛋白的表达受到明显的抑制,并且相关通路蛋白p-PI3K、AKT-pS473的表达也受到明显的抑制。结论:sOPN具有促进白色前脂肪细胞棕色化的能力,其作用机制可能是依赖于与细胞膜上的CD44受体结合的。然而,rhOPN则未发现具有上述效应。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R589.2

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本文编号：2601843