玉米卵磷脂制备、性质表征及其降血脂功效的研究

发布时间：2020-03-30 12:02

【摘要】：卵磷脂是一类普遍存在于生物界中的宝贵含磷类脂物质。卵磷脂作为构成生物体核膜、细胞膜及质体膜等生物膜中类脂的重要成分,在维持生物细胞膜的生理功能和正常机体代谢方面具有十分关键的调节作用。鉴于卵磷脂分子具有特殊的双极性结构,既含有亲脂性的脂肪酸烃的非极性端,又含有亲水性的胆碱基、磷酸根的极性端。卵磷脂这种特殊的分子结构决定了其具有多种生理活性和物化特性,可广泛应用在化妆品、食品及医药等行业中,是制备和生产各类医药制剂的辅料、乳化剂、调理剂及增溶剂等的理想原料。由于药用辅料的研发及产业化在我国一直是比较薄弱的环节,同时药用卵磷脂(口服与注射级别)产品研究开发的时间比较晚,而且其提取工艺技术复杂、难度大,而世界上能够掌握既有高纯度又能保持活性的药用卵磷脂生产技术仅有国外少数公司。目前,我国基本全部依靠进口药用卵磷脂来满足静脉注射脂肪乳和脂质体的生产需要。本研究以超临界CO_2萃取玉米油后的萃余物脱脂玉米胚芽为原料,采用超声波微波协同乙醇提取玉米卵磷脂(口服与注射两用),使PC、PE及LPC的含量符合进口注册标准的范围要求。然后对玉米卵磷脂的理化特性、磷脂组成、性质表征及乳化特性进行研究,最后构建高脂血症大鼠模型,对玉米卵磷脂(口服与注射两用)进行降血脂功效及急性毒性评价。我国玉米胚芽资源丰富,加工利用率较低,本研究成果如能在实际应用中得以顺利开展,不仅可大幅度提高玉米胚芽的附加值,延长玉米精深加工产业链,产生巨大的经济、社会及环境效益,还有助于缓解口服用和注射用卵磷脂长期依靠进口的形势,具有显著的应用价值与广阔的市场前景。研究内容及结果如下:(1)以超临界CO_2脱脂后玉米胚芽为原料,采用超声波微波协同乙醇提取玉米粗卵磷脂,通过单因素试验和正交试验考察料液比、超声波功率、微波温度和协同作用时间对玉米粗卵磷脂提取率的影响,固定乙醇浓度为95%。结果表明,最佳提取工艺条件为:料液比(g/mL)1:10、超声波功率230W、微波温度55℃、协同作用时间20min,在此条件下玉米粗卵磷脂的提取率为(81.24±2.35)%,显著高于超声波协同乙醇提取法、微波协同乙醇提取法和单独乙醇提取法。UPLC-ELSD法分析结果表明,玉米粗卵磷脂中PC含量最高,达到(62.25±2.12)%,PE含量次之,达到(26.67±0.35)%,而LPC的含量仅为(1.32±0.08)%。此外,玉米粗卵磷脂样品中还有少量的未知组分有待进一步研究。(2)以玉米粗卵磷脂为原料,采用乙醇冷冻纯化法提取玉米卵磷脂(口服与注射两用),通过单因素试验和正交试验考察料液比、乙醇浓度、冷冻温度和冷冻时间对玉米卵磷脂的提取率,PC含量,PE含量的影响。结果表明,最佳工艺条件为:料液比(g/mL)1:9、乙醇浓度95%、冷冻温度-14℃、冷冻时间45min,在此条件下玉米卵磷脂的提取率为(79.35±1.22)%,PC含量为(78.37±0.17)%,PE含量为(9.86±0.07)%,符合进口注册标准(JX20010249)的要求。(3)采用TLC及UPLC-ELSD法分析玉米卵磷脂(口服与注射两用)中的磷脂组成,结果发现PC含量最高,PE含量次之,而LPC的含量仅为(1.32±0.08)%,磷脂组成均符合进口注册标准(JX20010249)和《中国药典》2015年版的相关标准要求。对制备的玉米卵磷脂的重要质量指标相关的理化特性进行分析,结果表明产品各指标均在《中国药典》2015年版的可接受范围之内,甚至有些指标结果优于前人报道的注射级大豆卵磷脂。(4)采用FT-IR对玉米卵磷脂(口服与注射两用)样品进行性质表征分析,结果发现样品中在磷脂的特征官能团谱带强度较强,可知样品中磷脂含量较高。采用GC-MS对玉米卵磷脂样品、PC和PE组分的脂肪酸组成鉴定分析,结果发现这三种脂质均含有大量的亚油酸和油酸。对于亚油酸,PE组分含量最高,达到60.95%,玉米卵磷脂样品含量最低,只有45.99%。PC组分中油酸含量最高,达到24.51%。玉米卵磷脂样品中脂肪酸主要由棕榈酸(18.81%)、硬脂酸(3.92%)、油酸(22.31%)、亚油酸(45.99%)和亚麻酸(7.66%)组成,n-6/n-3比率(6.00)在世界卫生组织建议的安全值的可接受范围内。采用UPLC-ESI-TQ-MS/MS对玉米卵磷脂中不同磷脂组分的分子种类和含量进行分析,共检出6种PC和6种PE分子种类。PC类磷脂中,PC(36:3)、PC(34:2)和PC(36:2)分子种类的相对含量较高,而在PE类磷脂中,相对含量较高的分子种类为PE(36:4)和PE(34:2)。此外,PC和PE的溶血磷脂均由LPL(16:0)和LPL(18:0)这两种分子种组成,而且两者的相对含量都很低。将UPLC-ESI-TQ-MS/MS测定的所有脂肪酸链种类及相对含量与GC-MS分析结果相比较,表征结果高度吻合。(5)玉米卵磷脂(口服与注射两用)O/W型乳液的乳化稳定性、粒径分布及乳液微观形态分析与表征结果表明,增加乳化剂卵磷脂浓度可使乳液液滴尺寸减小,乳液稳定性增加。与添加相同浓度的注射用蛋黄卵磷脂作为乳化剂相比,玉米卵磷脂制备的O/W型乳液的稳定性更好。(6)构建高脂血症大鼠模型,对玉米卵磷脂(口服与注射两用)进行降血脂功分析,结果表明采用高脂饲料喂养大鼠2周后,通过尾静脉采血,测得模型组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平均显著高于空白对照组,表明高脂血症大鼠模型造模成功;通过分析大鼠血清指标数据,与模型组比较,高剂量组和中剂量组可明显降低高脂血症大鼠血清中TC和TG含量,而且高剂量组能显著降低LDL-C水平和提升HDL-C水平,表明高剂量组对高脂膳食大鼠血脂具有明显的降低作用;玉米卵磷脂能显著降低大鼠腹腔脂肪蓄积系数,且高剂量组优于其他各组;通过对大鼠肝脏中SOD和MDA含量进行分析,高剂量组能显著降低大鼠肝脏内MDA含量,提升肝脏内SOD水平,说明玉米卵磷脂具有抑制肝组织脂质过氧化和提高肝组织抗氧化能力的作用;从大鼠肝脏组织病理学观察来看,玉米卵磷脂(口服与注射两用)可改善高脂血症大鼠肝细胞脂肪变性损伤,其中以高剂量组的改善效果最佳。综上说明玉米卵磷脂具有辅助降血脂、保护肝脏功能。(7)小鼠急性毒性试验结果表明,玉米卵磷脂(口服与注射两用)最大灌胃给药量为28g/(kg·d),此剂量相当于临床剂量的235倍,给小鼠灌胃后,小鼠体重增值属于正常增长范围,未出现有中毒或者死亡现象,剖检后也没发现组织脏器有明显变化。与空白组比较,给药组差异无统计学意义,说明玉米卵磷脂安全可靠,属于无毒级。
【图文】：

准确称取25.00g脱脂玉米胚芽，以一定料液比加入一定浓度的乙醇溶液，，在温和的氮气流保护下置于微波-紫外-超声波三位一体合成萃取反应仪中，并与球形冷凝器连接（如图2.1所示）。设定磁力搅拌速度为300r/min，在一定的超声波功率和微波温度下协同作用一段时间，过滤取滤液，提取次数为2次。合并滤液，于50℃真空旋转蒸发脱除乙醇，加入35mL乙醚于蒸馏瓶中，充分溶解残留物，过滤取滤液。然后将滤液转移到冰浴（0℃）的烧瓶中，参考美国油脂化学协会（AOCS）标准方法AOCS Official Method Ja 4 46加入140mL冷丙酮（4℃），充分搅拌，倾析上清液，用20mL冷丙酮多次洗涤沉淀直至上清液无油迹为止[10, 92]。最后沉淀物用温和的氮气流吹干

然后分别移取每支比色管上层液倒入洁净、干燥的比色皿中，于650nm的波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，含磷量（mg）为横坐标，绘制标准工作曲线，如图2.2。得到的线性方程为：y=5.5279x+0.0051，线性相关系数R2=0.9993，呈良好的线性关系。其中y为吸光度，x为磷含量（mg）。2.2.4.3 玉米粗卵磷脂样品中磷脂含量的测定准确称取0.1-0.2g玉米粗卵磷脂样品置于50mL的石英坩埚中，加入0.5g氧化锌摇匀后放在万用电炉上慢火加热至样品变稠，然后逐渐加热至样品全部炭化。将石英坩埚置于马
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TS218;R589.2

【参考文献】

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本文编号：2607519