高脂条件下DHA对骨骼肌胰岛素抵抗的改善作用及分子机制研究

发布时间：2020-03-30 23:08

【摘要】：1目的随着人们生活质量的提高,饮食结构的转变,糖尿病尤其是2型糖尿病(T2DM)的发病率逐年升高,给家庭以及社会带来沉重的医疗负担。糖尿病人多数肥胖或超重,脂肪能量的摄入过多使血浆中游离脂肪酸水平升高,导致胰岛素靶组织摄取和利用葡萄糖的效率下降,产生胰岛素抵抗(IR)。胰岛素抵抗是造成T2DM的主要因素之一,同时也能诱发高血压、心脑血管疾病等代谢性疾病。因此,提高葡萄糖摄取,改善胰岛素敏感性已成为防治IR的重要措施。高脂条件下诱发的IR动物及细胞模型是研究IR发病机制及其防治措施的重要模型。DHA是主要存在于深海鱼油中的一种重要的n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA),其不仅在调节血脂和降低血压方面效果显著,还在葡萄糖的摄取及代谢,维持机体血糖平稳等方面也有积极作用。有研究显示饮食中n-3PUFA含量增加可使胰岛素抵抗的患病风险降低,还能增加大鼠胰岛素敏感性,但DHA在细胞水平上改善胰岛素抵抗的机制尚无明确研究。本实验在高脂条件下,研究富含DHA的深海鱼油对IR大鼠胰岛素敏感性的影响,并在细胞水平探究DHA在胰岛素信号传导通路中的作用,初步揭示DHA改善胰岛素抵抗及调控胰岛素信号传导通路的分子机制,为DHA在预防和改善胰岛素抵抗的实际应用中提供依据。2内容本实验用鱼油替代高脂日粮中的脂肪能量喂养胰岛素抵抗大鼠,在确保高脂日粮能量不变的前提下,分析鱼油饮食干预对IR大鼠胰岛素敏感性的影响;基于动物试验结果,选用适宜PA浓度成功构建IR-L6细胞模型后,用不同浓度的DHA干预细胞,进一步研究DHA对改善胰岛素抵抗和胰岛素信号传导通路的影响。综合动物试验和细胞试验结果,探讨DHA对胰岛素信号传导通路的调控作用及改善胰岛素抵抗的可能机制。3方法将60只SPF级雄性大鼠随机分成2组进行胰岛素抵抗造模:对照组(NC)12只、高脂组(HF)48只。将出现IR的HF组48只大鼠随机分为4组:HF、20%FO、50%FO和100%FO,每组12只。HF组继续给予高脂纯合日粮饲料,20%FO、50%FO和100%FO组分别为鱼油替代高脂日粮脂肪能量的20%、50%和100%。喂养4周,记录鱼油的摄入量,检测大鼠空腹血糖和胰岛素敏感性,Western blot检测IRS1和GLUT4的蛋白表达量。L6细胞先用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养至80%融合后换为含2%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养至长出肌管,加入浓度分别为0.25、0.5、0.75和1mmol/L的PA培养24h,根据细胞活性以及葡萄糖摄取量选出适宜的造模浓度。DHA干预实验一,IR-L6细胞模型中加入0.75 mmol/L PA和浓度分别为0.01、0.05、0.1和0.2mmol/L的DHA混合培养基;干预实验二,用0.75mmol/LPA和浓度分别为0.01、0.05、0.1和0.2mmol/L的DHA混合培养基共同干预细胞24h后,检测细胞活性以及葡萄糖摄取,real time q PCR检测胰岛素信号通路关键基因m RNA水平,Western blot检测胰岛素信号传导通路关键基因蛋白的表达。4结果4.1大鼠(1)造模结果显示,与NC组相比,HF组大鼠采食量及体重均显著增加;高胰岛素-正常血糖钳夹实验结果显示,HF组大鼠葡萄糖灌注率明显降低(P0.05),说明HF组大鼠产生胰岛素抵抗,提示造模成功;(2)与HF组相比,随FO替代比例的提高,FINS逐渐下降,100%FO组有显著性差异(P0.05);FPG无明显变化,ISI值明显上升(P0.05);(3)蛋白表达结果显示,HF组IRS1及GLUT4的蛋白表达较NC组分别下降了21%及19%(P0.05);与HF组相比,FO各组IRS1和GLUT4蛋白表达随鱼油替代比例的提高明显上升(P0.05)。4.2 L6细胞(1)L6细胞分化后形成肌型结构,排列较为规则,呈长梭形,细胞融合形成明显的肌管;(2)PA培养细胞24h后,与对照组相比,葡萄糖摄取量随PA浓度升高明显下降(P0.05),说明IR-L6细胞模型构建成功;Western blot结果显示,IRS1和GLUT4的表达随PA浓度的升高而下降;(3)DHA干预后,细胞活性明显升高(P0.05);葡萄糖摄取量随DHA浓度的增加而明显升高(P0.05);(4)DHA干预后,与PA组相比,随DHA浓度的升高,IRS1基因表达逐渐增加;PI3K及m TOR基因表达均随DHA浓度的升高而逐渐下降;Akt及PGC-1α基因表达在DHA浓度为0.01和0.05mmol/L时略有下降,但在0.1和0.2mmol/L时表达明显升高;GLUT4表达量随DHA浓度的升高而明显增加;(5)与PA组相比,DHA干预后IRS1、Akt和GLUT4蛋白表达随DHA浓度升高而增加,IRS1(Y612)蛋白表达量没有明显变化,IRS1(Ser636/639)及PI3K的表达随DHA浓度的升高而明显下降;m TOR、S6K、S6K(Thr389)蛋白表达随DHA浓度的升高而显著下降;PGC-1α蛋白表达逐渐升高,STARS表达量明显下降(P0.05)。5结论5.1大鼠(1)持续高脂饮食可使大鼠体重增加,胰岛素敏感性下降,产生胰岛素抵抗;鱼油干预后,胰岛素敏感性指数上升,提高了胰岛素敏感性;(2)鱼油高脂饮食可以提高IRS1及GLUT4蛋白表达,促进葡萄糖摄取,改善胰岛素抵抗。5.2 L6细胞(1)0.75mmol/LPA培养细胞24h可以诱发L6细胞胰岛素抵抗;(2)DHA干预能改善细胞活性,增加细胞葡萄糖摄取;(3)DHA通过抑制m TOR及S6K的表达从而激活IRS1/PI3K/Akt/GLUT4胰岛素信号通路,改善胰岛素抵抗;(4)DHA可通过提高PGC-1α的活性,抑制STARS的表达,从而提高IRS1和Akt的活性,增加IR-L6细胞胰岛素敏感性,促进葡萄糖摄取。
【图文】：

胰岛素,信号传导通路,信号传导

胰岛素信号传导通路Fig1Insulinsignalingpathway

鱼油,高脂饮食,蛋白表达,替代比

异(P<0.05)；FPG 无明显变化，ISI 值明显上升(P<0.05)，见表 1.4表 1.4 不同比例鱼油替换对胰岛素敏感性的影响Tab 1.4 Effect of different proportion of fish oil replacement on insulin sensitivitItem HF 20%FO 50%FO 100%S(mU/L) 0.614±0.102 0.514±0.226 0.54±0.082 0.407±(mmol/L) 4.814±0.703 4.991±0.716 4.559±0.394 4.572±ISI 0.352±0.074 0.438±0.131*0.422±0.107*0.556±示与 HF 组相比 P<0.05.Compared with group HF, P<0.05.蛋白表达 NC 组相比，，HF 组 IRS1 及 GLUT4 的蛋白表达下降明显（分别下降）；与 HF 组相比，FO 各组 IRS1 和 GLUT4 蛋白表达随鱼油替代比显上升(P<0.05)。见图 1.1
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1

【参考文献】