miR-625-5p对卵清蛋白诱导的支气管哮喘小鼠的作用及机制研究

发布时间：2020-04-01 22:51

【摘要】：背景与目的支气管哮喘是由多种细胞、细胞因子共同参与的一种异质性气道慢性炎症性疾病。据报道,此病患病率较高,可侵及各个年龄段,不仅严重影响人们的日常生活及工作,还给家庭和社会带来了极大的经济负担。最新研究发现,微小RNA(microRNA,miR)在支气管哮喘的发生发展中起着相当重要的作用。本课题组前期研究也证实了miR-625-5p可通过靶向蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT2)减轻经脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的支气管上皮细胞炎症表现。而本实验旨在体外构建由卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)诱导的支气管哮喘BALB/c小鼠模型,研究miR-625-5p对OVA诱导的支气管哮喘小鼠的影响及其可能的机制。方法1.OVA诱导BALB/c小鼠急性支气管哮喘模型的构建1.1.使用OVA联合氢氧化铝[Aluminium hydroxide,Al(OH)3]凝胶配置致敏液(每1ml致敏液含OVA0.05mg,Al(OH)320mg),以OVA致敏液于第0、7、14天对BALB/c小鼠腹腔注射致敏,第21天起用1%OVA溶液对BALB/c小鼠进行雾化激发支气管哮喘,持续雾化30分钟/天,连续5天,观察雾化时小鼠表现。1.2.在末次雾化激发后24h,处死BALB/c小鼠,行肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞计数分类;酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测总血清免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)E、OVA特异性IgE(OVA specific IgE,OVA-sIgE)及BALF中细胞因子白细胞介素(Interleukin,IL)-4的水平;肺组织苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色观察气道炎症细胞浸润情况。2.miR-625-5p上调对OVA诱导的支气管哮喘小鼠的影响2.1.将20只6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组:正常组(N组)、支气管哮喘组(OVA组)、干扰组(Ago组)及阴性对照组(NC组)。OVA组、Ago组、NC组BALB/c小鼠均于第0、7、14天使用0.2mlOVA溶液(OVA100μg,氢氧化铝凝胶4 mg)腹腔注射致敏,自第21天起用1%OVA溶液对BALB/c小鼠进行雾化,持续雾化30分钟/天,连续5天,激发BALB/c小鼠支气管哮喘发作。Ago组、NC组分别在第20、22、24天在雾化前30分钟尾静脉注射agomiR-625-5p(10nmol/只)和agomiR-NC(10nmol/只)的PBS溶液400μl。N组以等量无菌生理盐水代替相应量的OVA溶液对小鼠进行处理。2.2.在末次雾化激发后24h,使用动物肺功能仪测定不同乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)浓度刺激下BALB/c小鼠的气道阻力(Resistance of Lung,RL);通过肺组织病理切片HE染色观察气道炎症细胞浸润;ELISA法检测总血清IgE、OVA-sIgE及BALF中细胞因子IL-4的水平;显微镜下计数BALF中的细胞总数,再经瑞士吉姆萨染色后行BALF细胞分类计数统计;RT-qPCR法分析各组BALB/c小鼠肺组织中miR-625-5p、IL-6、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)-α的相对mRNA水平变化。2.3.蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测各小组小鼠肺组织AKT2及磷酸化AKT2(phospho-AKT2,p-AKT2)的蛋白表达水平变化。结果1.OVA成功诱导BALB/c小鼠支气管哮喘模型1.1.两组模型小鼠雾化时都表现出抓挠鼻尖、抓耳朵、打喷嚏、活动减少等现象。1.2.哮喘模型小鼠BALF细胞总数、嗜酸性粒细胞数较正常小鼠增加,肺组织HE染色可见明显炎症细胞浸润;以200μl/只致敏液致敏的小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数较0.1ml/只致敏液致敏的小鼠更高,肺组织炎症细胞浸润更明显。2.miR-625-5p对OVA诱导的小鼠哮喘表现有一定的抑制作用2.1.气道阻力:测肺功能时,随Ach激发雾化浓度梯度升高,N组小鼠气道阻力仅有轻微升高;OVA组和NC组小鼠气道阻力升高明显;Ago组气道阻力较OVA组显著下降(p0.05)。2.2.HE染色:N组小鼠支气管及肺组织结构正常,气道上皮黏膜完整,无纤毛脱落,炎症细胞浸润较少;OVA组和NC组小鼠肺组织切片染色可见气道黏膜明显肿胀,黏膜皱襞明显增多增厚,气道上皮细胞破坏明显,支气管及血管周围有大量炎细胞浸润;Ago组气道炎性细胞浸润较OVA及NC组明显减轻,气道上皮完整,水肿较轻。2.3.ELISA检测:OVA组和NC组小鼠血清总IgE、OVA-sIgE明显高于N组小鼠,Ago组小鼠血清总IgE、OVA-sIgE较OVA组明显降低(p0.05);较N组小鼠,OVA组和NC组小鼠BALF中细胞因子IL-4的水平增高明显,Ago组小鼠BALF中细胞因子IL-4较OVA组显著下降(p0.05)。2.4.BALF细胞计数:OVA组和NC组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数显著高于N组,Ago组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数明显低于OVA组(p0.05)。2.5.WB检测:OVA组和NC组小鼠肺组织p-AKT2的蛋白表达水平明显高于N组,Ago组小鼠肺组织p-AKT2的蛋白表达水平较OVA组明显下降(p0.05)。结论1.通过OVA成功构建了支气管哮喘小鼠模型,miR-625-5p可降低OVA诱导的支气管哮喘小鼠的气道高反应性,减轻气道炎性细胞浸润。2.miR-625-5p可能通过抑制AKT2磷酸化,从而调控下游细胞因子,最终抑制了OVA诱导的支气管哮喘模型小鼠的气道高反应性及气道炎性细胞浸润。
【图文】：

予气管插管，行肺泡灌洗2次，回收液体经离心、移取上清、重悬后，利用细胞计数版进行细胞计数，发现哮喘组小鼠肺泡灌洗液中细胞总数明显高于对照组小鼠肺泡灌洗液细胞数（见图1 a）。经再次重悬离心后，弃上清，行瑞士吉姆萨染色，，分类计数两组肺泡灌洗液细胞中嗜酸性粒细胞数，可见哮喘组小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞较对照组明显增高（见图1 b）。图 1 对照组和哮喘组 BCLB/c 小鼠肺泡灌洗液中细胞数的变化Figure 1 Changes of cell number in alveolar lavage fluid of BCLB/c mice incontrol group and asthma group（注：与对照组相比：*P<0.05）a b

3.3 对照组和哮喘组BALB/c小鼠肺泡灌洗液IL-4水平比较使用ELSA法计较对照组和哮喘组BALB/c小鼠肺泡灌洗液IL-4水平，可见哮喘组BALB/c小鼠肺泡灌洗液中IL-4水平显著高于对照组（见图2）。图2 对照组和哮喘组BALB/c小鼠肺泡灌洗液IL-4水平比较Figure 2 Comparison of IL-4 levels in alveolar lavage fluid of BALB/c mice incontrol and asthma groups（注：与对照组相比：*P<0.05）3.4 对照组和哮喘组BALB/c小鼠血清总IgE和OVA-sIgE水平比较使用ELSA法计较对照组和哮喘组BALB/c小鼠血清中总IgE和OVA-sIgE水平，可见哮喘组血清中总IgE和OVA-sIgE水平均显著高于对照组（见图3）。图3 对照组和哮喘组BALB/c小鼠血清总IgE和OVA-sIgE水平比较Figure 3 Comparison of serum total IgE and OVA-sIgE levels in BALB/c micein control and asthma groups（注：与对照组相比：*P<0.05）3.5 对照组和哮喘组BALB/c小鼠肺组织病理变化小鼠经眼球取血处理后，取肺组织于4%多聚甲醛溶液中固定，后行HE染色，结果示：对照组小鼠肺组织结构完整，支气管管壁规则，气道皱襞正常，未见明显水肿、皱襞增厚，血管及支气管周围未见明显细胞浸润（见图 4a）。哮喘组小鼠气道上皮细胞明显坏死、脱落；气道黏膜水肿明显，黏膜皱襞明显增多，且ab
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R562.25

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本文编号：2611064