小檗碱调节脂肪组织纤维化和肠道脂质吸收治疗肥胖症的机制研究

发布时间：2020-04-05 20:51

【摘要】：第一部分小檗碱抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织纤维化的作用及其机制目的探讨低、中、高剂量的小檗碱对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织纤维化的影响及其作用机制。方法采用60%高脂饲料喂养雄性C57BL/6小鼠16周,建立肥胖小鼠动物模型,并随机分为高脂饮食组、小檗碱低、中、高剂量组,其中低、中、高三个治疗组分别用100mg/kg体重、200 mg/kg体重、300 mg/kg体重剂量的小檗碱连续灌胃8周,另设普通饮食的正常对照组。比较各组小鼠体重、空腹血糖、GTT、ITT等差异。H(5)E染色观察小鼠附睾白色脂肪组织形态学改变;Masson’s Trichrome染色和Sirius Red染色检测附睾白色脂肪组织胶原蛋白沉积的变化;RT-qPCR检测附睾白色脂肪组织中细胞外基质组分Collegen I、Fibronection、α-SMA的基因转录水平;Western blot检测附睾白色脂肪组织中Collegen I、α-SMA、PDGFR-α的蛋白表达水平。用免疫组织化学的方法检测附睾白色脂肪组织中Fibronection、α-SMA的表达水平。Western blot检测附睾白色脂肪组织中缺氧诱导因子HIF-1α的蛋白表达水平,RT-qPCR检测附睾白色脂肪组织中LOX的基因转录水平。Western blot检测附睾白色脂肪组织中凋亡相关蛋白cleaved caspase3的蛋白表达水平。用免疫组化的方法检测附睾白色脂肪组织中cleaved caspase3的表达水平。结果小檗碱呈剂量依耐性减轻高脂饮食诱导的小鼠体重增加(p(27)0.01),增加葡萄糖清除率(p(27)0.05),改善胰岛素敏感性(p(27)0.05,p(27)0.01)。与普通饮食组相比,HFD组小鼠附睾白色脂肪组织细胞大小显著增加(p(27)0.01)。而BBR治疗减小了附睾脂肪组织的细胞大小(p(27)0.05,p(27)0.01)。Masson’s Trichrome染色和Sirius Red染色显示HFD组小鼠附睾白色脂肪细胞簇被束状和绳状胶原分割,胶原蛋白沉积增多。经BBR中、高剂量组处理后,胶原蛋白沉积明显减少(p(27)0.05)。与普通饮食组小鼠相比,HFD组小鼠附睾脂肪组织中细胞外基质组分Collegen I、Fibronection、平滑肌肌动蛋白α-SMA的基因转录增强(p(27)0.05,p(27)0.01)。然而,BBR抑制了这些基因的转录(p(27)0.05,p(27)0.01)。与普通饮食组小鼠相比,HFD组小鼠Collegen I、α-SMA、PDGFR-α、Fibronection蛋白表达增强(p(27)0.01),而BBR处理可抑制这些蛋白表达(p(27)0.05,p(27)0.01)。与普通饮食组小鼠相比,HFD组小鼠的附睾脂肪组织中的HIF-1α表达增多(p(27)0.01),BBR治疗抑制了小鼠eWAT中的HIF-1α表达(p(27)0.05,p(27)0.01)。与普通饮食组小鼠相比,作为HIF-1α的重要靶基因,HFD组小鼠的附睾脂肪组织中催化胶原蛋白修饰和交联的赖氨酰氧化酶(LOX)基因的转录水平增强(p(27)0.01),而BBR可降低LOX的基因转录(p(27)0.05,p(27)0.01)。此外,BBR尤其是高剂量组干预后减弱了HFD诱导的附睾脂肪组织中cleaved caspase-3的表达(p(27)0.05)。结论黄连有效成分小檗碱能调节高脂饮食诱导的肥胖小鼠代谢紊乱;减少高脂饮食诱导的肥胖小鼠附睾白色脂肪组织胶原沉积和细胞外基质成分的分泌,抑制脂肪组织纤维化,其机制可能与抑制白色脂肪组织中HIF-1α激活有关。第二部分小檗碱抑制肠道脂质吸收改善高脂血症的作用及其机制目的探讨小檗碱对高脂饮食诱导的肥胖动物模型和油酸诱导的Caco-2和FHs 74Int肠上皮细胞脂肪酸吸收模型对脂质吸收的影响及其作用机制。方法采用60%高脂饲料喂养雄性C57BL/6小鼠16周,建立肥胖小鼠动物模型,并随机分为高脂饮食组及小檗碱低、高剂量组,另设普通饮食的正常对照组。其中低、高两个治疗组分别用150mg/kg体重、300 mg/kg体重剂量的小檗碱连续灌胃8周。药物干预过程中记录小鼠体重及进食量。分别行GTT、ITT和血脂指标检测评估小鼠的糖脂代谢变化。HE染色观察小鼠肝脏形态学变化,油红O染色观察肝脏脂肪沉积情况。HE染色观察小鼠附睾白色脂肪组织形态学变化,免疫组化法检测小鼠附睾白色脂肪组织巨噬细胞表面标志物F4/80的表达水平。HE染色观察近端小肠形态学变化,油红O染色检测橄榄油灌胃30min后近端小肠脂质沉积情况。Western blot检测近端小肠组织中CD36、FATP4、m TOR、NPC1L1、Numb的蛋白表达水平。用油酸和BBR联合干预Caco-2细胞,先用10μM、20μM、30μM小檗碱预处理Caco-2细胞,30min后加100m M油酸干预24h。然后用BODIPY染色检测Caco-2细胞脂肪酸吸收情况。Western blot检测CD36、FATP4的蛋白表达水平。用油酸和BBR或雷帕霉素(m TOR抑制剂)联合干预FHs 74Int细胞,先用10μM、20μM、30μM小檗碱或50n M雷帕霉素预处理FHs 74Int细胞,30min后加100m M油酸干预24h。然后用BODIPY染色检测FHs 74Int细胞脂肪酸吸收情况。Western blot检测m TOR、CD36、FATP4的蛋白表达水平。结果体重和摄食结果提示小檗碱能抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠体重增加且不影响小鼠摄食量。GTT和ITT结果提示小檗碱能改善肥胖小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗。与普通饮食组小鼠相比,高脂饮食组小鼠附睾白色脂肪细胞体积增大,炎症浸润增多,肝脏脂肪沉积增加,而小檗碱可明显改善这些外周组织的代谢紊乱。小鼠近端小肠的长度和组织形态在各组间无显著差异,而与普通饮食组相比,高脂饮食组小鼠近端小肠脂质沉积增多,BBR可明显改善近端小肠脂质沉积。与高脂饮食组小鼠相比,BBR可增加粪便甘油三酯的排泄(p(27)0.01)。与普通饮食组小鼠相比,高脂饮食组小鼠近端小肠脂质转运相关蛋白CD36、FATP4、m TOR、NPC1LL1、Numb表达显著增加,而小檗碱治疗组以上蛋白的表达明显降低(p(27)0.05,p(27)0.01)。油酸干预的Caco-2细胞和FHs 74Int细胞中脂质沉积明显,小檗碱可抑制上述细胞中脂质沉积。与对照组相比,油酸干预组Caco-2细胞和FHs 74Int细胞中脂肪酸转运相关蛋白CD36、FATP4表达增加(p(27)0.01),而小檗碱可抑制这些蛋白的表达(p(27)0.01),且在FHs 74Int细胞中雷帕霉素可抑制CD36、FATP4蛋白表达(p(27)0.01)。结论小檗碱可有效降低高脂诱导的肥胖动物模型中肠道脂质吸收,增加粪便甘油三酯排泄,从而降低血脂水平,并可下调胆固醇转运相关蛋白NPC1L1和Numb的表达,同时下调脂肪酸转运相关蛋白CD36、FATP4及m TOR的表达。细胞实验进一步证实小檗碱抑制肠上皮细胞脂肪酸吸收,降低脂肪酸转运蛋白CD36、FATP4的表达,而小檗碱调控m TOR的表达可能是其作用机制之一。
【图文】：

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华中科技大学博士学位论文抗为了检测 BBR 能否改善 HFD 诱导的代谢紊乱，，7 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠给予HFD 16 周，然后再给予 BBR 干预 8 周。与 HFD 组小鼠相比，BBR 显著降低小鼠体重增加（图 1-1A）。HFD 显著增加了小鼠空腹血糖水平，而 BBR 治疗有效降低了 HFD诱导的血糖升高（图 1-1 B）。此外，葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验表明，BBR处理的小鼠葡萄糖清除率增加（图 1-1 C），胰岛素敏感性提高（图 1-1 E）。我们还计算了 GTT（图 1-1D）和 ITT（图 1-1F）曲线下的面积（AUC），这些结果表明，BBR治疗显著改善了葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。

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图 1-2 小檗碱对 HFD 诱导的肥胖小鼠的 eWAT 纤维化的影响注：A, 附睾脂肪切片 H＆E 染色的组织学分析。B, 脂肪细胞面积统计图，通过 ImagePro Plus 软件分析脂肪细胞面积。C 和 E 分别为 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色反应附睾白色脂肪组织中胶原的沉积。D 和 F 分别为 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色阳性区域统计图（n = 4）。数据显示为 X±SEM。与正常饲料（NC）组相比，**p <0.01;与高脂肪饮食（HFD）组相比，＃P <0.05，##P <0.01。3. BBR 抑制 HFD 小鼠 ECM 蛋白异常合成BBR 减少胶原沉积可能通过调节 ECM 蛋白的合成和分泌。RT-qPCR 结果显示，与普通饮食组小鼠相比，HFD 组小鼠 eWAT 中胶原蛋白 I（Collegen I）、纤维连接蛋白（Fibronection）、平滑肌肌动蛋白（ -SMA）的基因转录增强。然而，BBR 抑制了这些基因的转录（图 1-3A，B，C）。用 Western blot 检测 Collegen I、 -SMA、PDGFR-
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R589.2

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