2型糖尿病认知功能障碍小鼠海马组织LncRNAs表达谱分析

发布时间：2020-04-19 04:20

【摘要】：第一部分:提取方不同法对小鼠海马AD相关蛋白电泳的影响目的:探索不同提取方法对小鼠海马AD(Alzheimer's Disease)相关蛋白电泳结果的影响,为更准确地研究不同干预条件下AD小鼠模型中海马AD相关蛋白表达量的变化提供研究基础。方法:分别采用新鲜组织试剂盒提取法、新鲜组织超声波破碎法、速冻组织试剂盒提取法和速冻组织研磨法提取C57BL/6小鼠海马组织蛋白,然后利用SDS-PAGE电泳技术进行蛋白分离,考马斯亮蓝染色观察不同提取方法中蛋白条带的分布和数量,并进一步通过Western Blot分析不同提取方法对脑组织特异性蛋白免疫印迹结果的影响。结果:四种提取方法均能有效提取脑组织蛋白,其中新鲜组织超声法提取的海马组织蛋白总量最高。考马斯亮蓝染色结果显示:新鲜组织超声法提取的海马组织蛋白条带最为清晰,条带数量最多;但Western Blot分析结果显示:Tau phosphoSerine 396通过新鲜组织试剂盒提取法获得的蛋白条带丰度最高,而Neurofilament-L通过新鲜组织超声波破碎法和速冻组织试剂盒法所获得的蛋白条带丰度最高,其他AD相关蛋白采用速冻组织研磨法均可获得较高丰度的特异性蛋白条带。结论:不同蛋白提取方法对不同脑组织蛋白的提取效率存在明显差异,速冻组织研磨法可高效提取大部分小鼠海马AD相关蛋白。第二部分:2型糖尿病小鼠认知功能评价及海马AD相关蛋白和lnc RNAs的差异表达分析目的:2型糖尿病是认知功能减退和痴呆的高危因素,但其病理机制尚不清楚。lnc RNA(long non-coding RNA)是一类长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的功能性RNA分子,近年来许多研究表明,lnc RNA与AD的发生发展密切相关。本研究以lnc RNA为切入点,利用基因芯片及生物信息学技术,筛选2型糖尿病认知功能障碍db/db小鼠海马组织中差异表达的lnc RNA和m RNA,以期发现lnc RNA参与2型糖尿病认知功能障碍发生发展的新机制。方法:通过小鼠Y迷宫与新事物识别实验分别评估db/m对照组鼠和2型糖尿病db/db鼠的空间工作记忆能力和短时记忆能力,然后分别提取两组小鼠海马组织的总蛋白和总RNA,并利用蛋白质免疫印迹技术和基因芯片技术分别对海马AD相关蛋白以及lnc RNA和m RNA进行差异表达分析,采用散点图、聚类分析等方法,展示lnc RNA及m RNA差异基因的分布情况,通过GO分析和KEGG分析,对差异表达lnc RNA的邻近差异表达m RNA的功能进行聚类富集分析,预测差异表达lnc RNA可能涉及的生物过程及参与的信号通路。采用实时荧光定量PCR方法对筛选的差异表达lnc RNA和m RNA进行检测和验证,并构建差异表达的lnc RNA-m RNA共表达网络。结果:行为学结果显示,与db/m小鼠相比,db/db糖尿病小鼠的空间记忆力和短时记忆能力显著下降(P0.01);Western Blot结果显示,与db/m小鼠相比,db/db小鼠海马组织中P-GSK3β蛋白表达显著升高,磷酸化tau蛋白(p-tau Ser396)与总Tau蛋白(tau 46)比值以及α-Synuclein,P-GSK3α蛋白表达也有明显增高趋势;基因芯片检测结果显示,两组小鼠显著性差异表达的lnc RNAs共有75个,其中,相比正常db/m组,db/db组小鼠海马组织上调的lnc RNAs有22个,下调的lnc RNAs有53个,芯片数据同时表明显著性差异表达的m RNAs共有27个,其中,db/db组小鼠海马组织上调的m RNAs有17个,下调的m RNAs有10个;采用实时荧光定量PCR技术对芯片差异表达的基因进一步验证,随机挑选6个差异表达的lnc RNA和8个差异表达的m RNA进行RT-PCR验证,RT-PCR结果与lnc RNA芯片检测结论一致;对db/db鼠和db/m鼠海马组织差异表达lnc RNAs做cis靶基因预测,cis靶基因GO富集分析结果显示lnc RNAs涉及下列生物学过程,蛋白质定位调控、磷酸化信号转导、蛋白激酶活化和MAPK级联,这些基因功能在学习记忆中及AD发展中发挥重要功能;cis靶基因KEGG通路分析结果显示差异表达lnc RNAs相关的编码基因涉及下列通路,VEGF信号通路、MAPK信号通路、GABAergic synapse,这些通路在神经系统调控过程中发挥重要功能;lnc RNA-m RNA共表达网络分析包含了6个lnc RNAs和20个m RNAs,结果明确了lnc RNA与m RNA的相关性。结论:本研究展示了与2型糖尿病认知功能损伤相关的海马lnc RNA差异表达谱,并预测了差异表达的lnc RNA可能参与糖尿病认知功能损伤发生发展的多条信号调控通路,本研究结论将为今后进一步研究2型糖尿病认知功能损伤的发病机制提供新的思路和线索。
【图文】：

四种提取方法均能有效提出小鼠海马脑组织总蛋白（图1-1），其中蛋白产量最高的是新鲜组织超声波破碎法（111.47±8.00）mg/g，，其次是新鲜组织试剂盒提取法（81.30±4.01）mg/g，速冻组织研磨法（63.84±3.30）mg/g，速冻组织试剂盒提取法蛋白提取产量最低（52.16±8.95）mg/g。图 1-1 采用 4 种蛋白提取方法，组 1：新鲜组织试剂盒提取法；组 2：新鲜组织超声波破碎法；组 3：速冻组织试剂盒提取法；组 4：速冻组织研磨法，分别提取海马组织蛋白。aP＜0.05 vs 组 3 和组 4,bP＜0.01 vs 组 3 和组 4。Figure 1-1 Protein contents in mouse hippocampal tissue extracts as estimated by four protein extractionmethods. Group 1, 2, 3, 4 is commercial Kit method for fresh tissue, ultrasonic-assisted method for freshtissue, commercial Kit method for grinding quick-freezing tissues and liquid nitrogen grinding method,respectively.aP＜0.05 vs group 3 and 4,bP＜0.01 vs group 3 and 4.4.2 不同提取方法所获得小鼠海马脑组织总蛋白质的 SDS-PAGE 电泳分析四种提取方法所获得的蛋白经 SDS-PAGE 电泳和考马斯亮蓝染色，结果显示 (图 1-2)

所得蛋白经 SDS-PAGE 电泳和考马斯亮蓝染色，泳道 1,2,3法；组 2，新鲜组织超声波破碎法；组 3，速冻组织试剂盒ie brilliant blue stained gel from the SDS-PAGE of proteins four protein extraction methods. Lanes 1, 2, 3 and 4 are Commercial Kit method for fresh tissue; Lane 2. Ultrasonic-asmercial Kit method for grinding quick-freezing tissues; La法对不同脑组织特异性蛋白提取效率的 Wes同蛋白提取方法对小鼠海马脑组织特异性蛋别利用针对不同AD相关蛋白的抗体进行W
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2

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本文编号：2632921