吡非尼酮抑制Hedgehog信号通路延缓肺纤维化

发布时间：2020-04-20 13:44

【摘要】：研究背景:系统性硬化症相关肺间质病变(SSc-ILD)是影响SSc预后的重要因素。Hedgehog(Hh)通路在动物的发育过程中调节细胞增殖、分化,Suppressor of fused(Sufu)是该通路中一个关键的负性调控因子。当配体缺乏时,转录因子GLIs与Sufu结合,使GLIs不能发挥转录效应。无论在体(小鼠)还是体外(细胞)实验中,Sufu基因沉默后观察到Hedgehog信号通路过度激活,该通路的过度激活与肺、心脏、肾、肝和皮肤纤维化有关。吡非尼酮被证实具有抗炎和抗纤维化的作用,然而机制仍不明确。基于上述研究现状,我们提出假设:吡非尼酮可能通过调节Sufu影响Hh通路面发挥抗纤维化的作用。目的:明确吡非尼酮是否通过上调Sufu影响Hh信号通路发挥抗纤维化作用,以促进吡非尼酮在与Hh信号通路相关的疾病中的应用。方法:第一部分:气管内滴注博来霉素后第7天行支气管肺泡灌洗(BAL),分析炎性细胞数及IL-6水平,观察吡非尼酮抗炎作用;第14天取肺组织观察肺损伤情况,观察 α-SMA、collagen I、TGF-β1、Glil、Sufu 表达情况。第二部分:慢病毒转染小鼠肺成纤维细胞,使其过表达Sufu,观察Gli1、Gli2水平的变化,并进一步观察Sufu过表达对TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞的表型转化(α-SMA水平)胶原蛋白collagen ⅠI水平的影响。第三部分:取健康者、未经吡非尼酮治疗的SSc-ILD、接受吡非尼酮治疗的SSc-ILD肺组织,观察肺组织Gli1表达水平;取健康捐献者、未经吡非尼酮治疗的SSc-ILD肺成纤维细胞行原代细胞培养,并用吡非尼酮刺激培养SSc-ILD肺成纤维细胞,观察细胞Gli1、Gli2、膜受体PTCH-1、Sufu、α-SMA、FN水平;用吡非尼酮和通路激动剂smoothened agonist(SAG)刺激培养正常捐献者的肺成纤维细胞,观察Gli1、Sufu、α-SMA、FN水平和细胞增殖、迁移、凋亡情况;观察经吡非尼酮刺激后细胞pGSK-3β/GSK-3β、pSMAD2/SMAD2和pJNK/JNK水平。结果:第一部分:1.经博来霉素处理后,与非吡非尼酮组相比,吡非尼酮组小鼠BALF中的IL-6、细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞少,肺损伤评分、肺组织TGF-β1、α-SMA、Collagen I表达低,Sufu表达水平高,Gli 1表达水平低。第二部分:1.与未经慢病毒转染的细胞相比,转染后的细胞Sufu表达增高,Gli1、Gli2、表达下降,经TGF-β1刺激后,Sufu过表达的细胞α-SMA、FN表达水平下降。第三部分1.与健康捐献者比较,未接受吡非尼酮治疗的SSc-ILD肺组织Gli1、Gli2、PTCH-1表达水平高;与未接受吡非尼酮治疗的SSc-ILD比较,接受吡非尼酮治疗的SSc-ILD肺组织Gli1表达水平明显降低,GLI2、PTCH-1 mRNA水平虽然下降,但无统计学意义。2.与未经吡非尼酮刺激的SSc-ILD的肺成纤维细胞比较,经刺激的细胞Sufu表达明显升高,Gli1、α-SMA、FN水平明显下降。3.与单独SAG刺激培养的细胞相比,SAG与吡非尼酮共刺激的细胞Sufu表达上调,Gli1、α-SMA、FN、TGF-β1的表达下降,细胞增殖、迁移、抗凋亡能力下降。4.经吡非尼酮刺激培养的SSc-ILD肺成纤维细胞pGSK-3β/GSK-3β较无刺激的细胞低,而pSMAD2/SMAD2和pJNK/JNK无明显变化。结论:吡非尼酮通过上调Sufu抑制Hh信号通路发挥抗纤维化作用。
【图文】：

逑胞虽然在吡非尼酮组增加较少（０．９２邋±邋０．１８邋ｖｓ．０．８７邋±邋０．２０＊邋１０５；ｊｐ＝．８５），但无统计学逡逑意义（图１．１）。逡逑ＩＬ－６是另一个反应炎症程度的指标，我们在支气管肺泡灌洗液中用ＥＬＩＳＡ逡逑方法检测了邋ＩＬ－６蛋白水平。在非吡非尼酮组，博来霉素可明显增加ＩＬ－６的水平逡逑（１６＿４６±２＿５１邋ｖｓ．８．５７±２．４１邋ｐｇ／ｍｌ，；？＝＿０４，ｎ＝６ｍｉｃｅｐｅｒｇｒｏｕｐ），而经博来霉素处理后，逡逑吡非尼酮组小鼠支气管肺泡灌洗液中的ＩＬ－６水平明显较非吡非尼酮组低逡逑（１６．４６土２．５１邋ｖｓ．８．６７±２．１５邋ｐｇ／ｍｌ，邋ｐ＝．０３，，ｎ＝６邋ｍｉｃｅ邋ｐｅｒ邋ｇｒｏｕｐ）（图邋１．１）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ｍ逦ＢＬＭ逦＊逡逑＇＊逦□邋ｎｏ邋ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逦０逦□□0邋ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逡逑ｉ逦Ｑ邋ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逦□ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逡逑°８，邋＃邋２0－逡逑ｘ逦Ｌ逦ｇ逦Ｉ逦？逡逑Ｓ邋１５邋Ｔ逦Ｔ邋Ｔ逡逑芸逦＊逦Ｉ逦ａ逡逑￡４，逦ｔ邋ｎｆ逦ｃｄ邋ｉ0－逡逑Ｗ邋Ｉ邋ＪＬ＃邋Ｉ逦Ｎｏ邋ＢＬＭ逦ｉ逦￣￣￣￣逦＿￣￣邋￣邋—逡逑0邋＾逦Ｉ逦ｆ邋Ｌ逦—逡逑ｉ邋＊逦５逡逑／／／／逦＇／／／／邋ＢＬＭ邋°逦－邋１邋＋逡逑＾逦ｎｏ邋ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ邋ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逡逑图１．１吡非Ｍ

本文编号：2634606