蛋白激酶C通路特异性甲状旁腺素模拟肽在连续应用时对骨骼系统作用的研究

发布时间：2020-04-21 20:14

【摘要】：背景:甲状旁腺素(Parathyoid Hormone,PTH)是正常人体内的钙调节激素,N端34个氨基酸多肽(PTH(1-34),特立帕肽)是临床上治疗骨质疏松的促骨形成药物,但仅限于间断使用。这是由于其兼具破骨作用,因此在体内连续应用会显著促进骨吸收;近年来的研究都主要着重于提高其成骨作用、避免破骨作用,但进展甚微。PTH能够与甲状旁腺素Ⅰ型受体结合,激活蛋白激酶C(PKC)通路,从而改善和提高松质骨骨量,并且它还能够改善骨小梁的微观结构。在我们前期实验中,我们已经验证并合成了能够特异性激活PKC通路的PTH模拟肽(MY-1),通过对其进行离体和在体实验,我们发现MY-1肽具有促进成骨细胞分化,但不激活破骨细胞分化和增殖的作用。体内实验研究发现,MY-1肽拥有与PTH(1-34)相近的改善或延缓去势后造成的骨量丢失的作用。PTH肽连续作用对骨代谢的影响是研究它破骨效应研究的重要方式。目的:通过我们前期合成的特异性激活PKC通路的PTH模拟肽进行体内和体外实验,探讨适于PTH持续灌注对骨骼系统的作用研究合适的动物模型,评价MY-1肽连续应用时的骨质变化。方法:取5只8周龄小鼠(C57BL/6J)提取股骨和胫骨的骨髓基质细胞(BMSC)、骨髓源巨噬细胞(BMMs);成骨诱导BMSC细胞,对细胞采用茜素红染色、钙定量分析、碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性测定,破骨诱导BMMs,对细胞进行TRAP染色及抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定;提取3日龄左右乳鼠(C57BL/6J)的颅骨原代成骨细胞,通过RT-PCR测定特异性成骨基因表达水平。取24只6周龄C57BL/6J雌性小鼠,适应性喂养一周后,随机取12只小鼠行卵巢切除术,术后观察一周,对OVX-TPTD组和TPTD组植入ALZET2004型微量缓释泵模拟连续使用TPTD。在第2周末行颈椎脱臼法处死后常温固定,取其胫骨进行MicroCT扫描,对松质骨进行定量分析,取胫骨做石蜡切片,进行HE及TRAP染色,观察骨小梁和破骨细胞分布情况,观察胫骨生长板厚度。取18只7周龄C57BL/6J雌性小鼠,通过对处理组植入ALZET2004型微量缓释泵模拟连续使用PTH(1-34)和MY-1肽。在第2周末行颈椎脱臼法处死后常温固定,取其胫骨进行MicroCT扫描,对松质骨进行定量分析,取胫骨做石蜡切片,进行HE及TRAP染色,观察骨小梁和破骨细胞分布情况,观察胫骨生长板厚度。结果:(1)胫骨松质骨骨量的测定,骨小梁体积分数PTH(1-34)组低于SHAM组,但MY-1组骨小梁体积分数与SHAM组略高于SHAM组,且明显高于PTH(1-34)组。OVX组显著低于SHAM组,PTH+OVX组显著高于OVX组。胫骨上段病理切片显示:骨小梁所占面积百分数,PTH(1-34)组、MY-1组与SHAM组显著性差异,OVX组显著低于SHAM组,PTH+OVX组显著高于OVX组。胫骨上段骨小梁发生区的厚度PTH(1-34)组和OVX组明显低于SHAM组,MY-1组与SHAM组无统计学差异,PTH+OVX组明显高于OVX组。(3)BMSC成骨诱导结果:茜素红染色示,PTH(1-34)组较对照组红色结节面积较少MY-1组红色结节面积明显高于对照组;碱性磷酸酶染色示,CON组、PTH(1-34)组、MY-1组均出现深蓝色染色,且PTH(1-34)组和MY-1组染色明显较对照组深,ALP定量检测示,酶活性在PTH(1-34)组出现降低、MY-1组的酶活性显著提升,PTH(1-34)vsMY-1;(4)BMMs破骨诱导结果:TRAP染色提示PTH(1-34)组和MY-1组TRAP阳性细胞数目明显增高,且均较CON组更多,但MY-1组破骨细胞增多数目较少;抗酒石酸酸性磷酸酶定量测定显示PTH(1-34)组和MY-1组的酶活性与CON组相比均有升高,但PTH(1-34)组TRAP酶活性高于MY-1组,两组间有统计学差异。(5)颅骨原代和BMSC细胞RT-PCR结果:成骨相关特异性基因(ALP、BSP、OC、OPG)表达,PTH(1-34)组相比对照组明显抑制,MY-1组相对于对照组明显上调。PTH(1-34)组相对于对照组,Rankl基因表达明显上调,MY-1组与对照组相比则表现出抑制。结论:细胞和动物实验综合显示,MY-1肽具有比PTH更好的促进成骨分化的作用,并且未表现出和PTH 一样的促进破骨分化的作用。由于MY-1肽在PKC通路的特异性,提示PKC信号通路可能特异性促进成骨分化。MY-1肽具有局部应用的可能。在研究甲状旁腺素连续应用的过程中,我们发现去卵巢小鼠和正常小鼠显现的效果不一致,雌激素对PTH连续应用的影响、机理和临床效应需要深入研究,但提示我们在实验动物模型的选择和研究结果解读需要更加慎重。
【图文】：

诱导分化,孔板,胶原,定量检测

图１－ｌＢＭＳＣｓ成骨诱导分化以及ＢＭＭｓ的破骨诱导分化Ａ：邋ＢＭＳＣ和ＢＭＭｓ接种于被Ｉ型逡逑胶原包被的２４孔板中，采用４８小时为一周期，持续药物刺激的给药模式。１４天连续成骨逡逑诱导后进行ＡＬＰ染色；对连续成骨诱导２８天后的ＢＭＳＣ细胞，进行茜素红染色；对ＢＭＭｓ逡逑进行破骨诱导７天后进行ＴＲＡＰ染色（扫描仪图像）。Ｂ：邋ＢＭＳＣ成骨诱导１４天后的ＡＬＰ逡逑定量检测（＊邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓＣｏｎｔｒｏｌ，＃Ｐ＜０．０５邋ｖｓＰＴＨ）邋；Ｃ：ＢＭＳＣ成骨诱导２８天后钙离子浓度逡逑定量检测（＊邋Ｐ＜0．0５邋ｖｓＣｏｎｔｒｏ〖，＃Ｐ＜０．０５邋ｖｓＰＴＨ）邋；邋Ｄ：连续破骨诱导７天后的ＢＭＭｓ的逡逑ＴＲＡＰ酶定量检测（＊邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ，邋＃邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋ＰＴＨ）逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＢＭＳＣｓ邋ａｎｄ邋Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＢＭＭｓ逡逑Ａ：邋ＢＭＳＣｓ邋ａｎｄ邋ＢＭＭｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ａ邋２４－ｗｅｌｌ邋ｐｌａｔｅ邋ｃｏａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｙｐｅ邋Ｉ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｕｓｉｎｇ邋ａ逡逑４８－ｈｏｕｒ邋ｃｙｃｌｅ邋ｔｏ邋ｍａｉｎｔａｉｎ邋ａ邋ｄｒｕｇ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｍｏｄｅ邋ｏｆ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．邋ＡＬＰ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ逡逑ａｆｔｅｒ邋１４邋ｄａｙｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ邋ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋ＢＭＳＣ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ邋２８邋ｄａｙｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ逡逑２２逡逑

信号模拟,特异性,定量检测,诱导分化

Ｃ逦Ｄ逡逑图１－ｌＢＭＳＣｓ成骨诱导分化以及ＢＭＭｓ的破骨诱导分化Ａ：邋ＢＭＳＣ和ＢＭＭｓ接种于被Ｉ型逡逑胶原包被的２４孔板中，采用４８小时为一周期，持续药物刺激的给药模式。１４天连续成骨逡逑诱导后进行ＡＬＰ染色；对连续成骨诱导２８天后的ＢＭＳＣ细胞，进行茜素红染色；对ＢＭＭｓ逡逑进行破骨诱导７天后进行ＴＲＡＰ染色（扫描仪图像）。Ｂ：邋ＢＭＳＣ成骨诱导１４天后的ＡＬＰ逡逑定量检测（＊邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓＣｏｎｔｒｏｌ，＃Ｐ＜０．０５邋ｖｓＰＴＨ）邋；Ｃ：ＢＭＳＣ成骨诱导２８天后钙离子浓度逡逑定量检测（＊邋Ｐ＜0．0５邋ｖｓＣｏｎｔｒｏ〖，＃Ｐ＜０．０５邋ｖｓＰＴＨ）邋；邋Ｄ：连续破骨诱导７天后的ＢＭＭｓ的逡逑ＴＲＡＰ酶定量检测（＊邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ，邋＃邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋ＰＴＨ）逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＢＭＳＣｓ邋ａｎｄ邋Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＢＭＭｓ逡逑Ａ：邋ＢＭＳＣｓ邋ａｎｄ邋ＢＭＭｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ａ邋２４－ｗｅｌｌ邋ｐｌａｔｅ邋ｃｏａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｙｐｅ邋Ｉ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｕｓｉｎｇ邋ａ逡逑４８－ｈｏｕｒ邋ｃｙｃｌｅ邋ｔ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R580

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